生物标志物综述—药物研发的催化剂
2011-05-02 20:20:05 来源： 作者： 评论：0 点击：
关后，马里兰州Rockville市的临床实 验公司Correlogic Systems快速跟进了这个项目。他们最终获得的生物标志物名为OvaCheck，不过目前还处于最后的调试阶段，专家们似乎都对此类产品最终走向市场 充满信心。同时，为了使他的员工能跟上这种技术的步伐，FDA已经开始从各家公司征集蛋白质组学数据，因为新的基于蛋白质组学的检测产品已经开始进入调试 阶段了。
芯片、滤柱还是凝胶？
虽然越来越多制药公司和诊断公司开始采用传统的方法，例如ELISA来验证生物标志物，但更多公司坚信，还有更好的解决方案。德国 Protagen公司的研究人员目前正用蛋白质芯片来筛选自身抗体的生物标志物。在一个典型实验中，科研人员用病人的血清和载有人类重组蛋白的实验板进行 反应。这些重组蛋白代表的是胎儿脑组织的蛋白质组。该公司的CEO Christoph Huels说道：“我们用包含有10000种蛋白质分子的实验板来筛选病人血清，发现了一种特别的自身抗体识别模式，这种模式可用于疾病诊断。”
Huels还提到，运用蛋白质生物芯片诊断多发性硬化（MS）可以达到超过80%的敏感性和特异性。
用芯片系统来发现和验证生物标志物分子，有助于将这种检测方法快速应用于临床，但当然也存在相应的缺点。例如，芯片只能检测自身抗体，并且被检测的靶抗原必须是公司实验板中存在的重组蛋白质。
但无论如何，Huels强调，该芯片系统将会比预期有着更广泛的用途。一开始，它也许只能用于自身免疫疾病的相关检测。但到目前为止，该芯片系 统在他们所检测的所有疾病中都是有效的。除了多发性硬化，Protagen公司还发现了阿尔茨海默氏病和前列腺癌的特异性自身抗体谱，研究人员还确认了秃 发症和扩张性心肌病的检测目标。
Protagen公司目前侧重于药物开发计划，但他们并不是唯一一家研究抗体芯片筛选的公司。那些想从货架上购买该技术的科研人员可以直接致 电Invitrogen公司，该公司的蛋白质组检测产品可以提供数种自身抗体检测芯片。这些芯片一次能检测多达8000种蛋白质，并且每次只需仅仅1微升 血清或血浆作为检测样品。
可是对于许多仪器制造商和基础研究人员来说，生物标志物的发现还是集中于传统的实验技术之上，特别是液相色谱和质谱分析技术。值得庆幸的是 这些技术近年来得到了飞速的发展（见《高通量质谱分析》，Science 319:1115, 2008），公司也开发了新型设备，专门用于发现生物标志物。
筛选生物标志物的其中一个问题就是从血清或其它生物体液中去除掉大部分的常见蛋白，以检测更罕见、信息量更大的蛋白信号，这些蛋白信号可能就 是优秀的生物标志物。多个研究团体都倾向于用免疫耗竭柱（immunodepletion column）来进行这一步骤， Bio-Rad公司近来开发出了一个新产品——ProteoMiner。
Aran Paulus是公司蛋白质组学研究和发展部经理，他指出，Bio-Rad公司将结合在柱子上的抗体换成许多不同的六肽，于是构成了一个化学合成物的组合文 库。大部分血清蛋白都至少与柱子中的一种六肽结合，但一旦六肽饱和，过量的蛋白就会被冲洗掉。待柱子被冲洗过后，研究人员再洗脱出结合到柱子上的蛋白，这 些蛋白的浓度范围小得多。按照公司的说法，普通的蛋白都会被洗掉，但罕见的蛋白则仍然存留于柱上。
不论研究人员开始准备样品时采用何种策略，在进行质谱分析前通常都必需对样品进行额外的纯化工作。对许多现代生物标志物筛选过程来说，这意味着需要纳米级的高分辨率液相色谱系统，该系统通常直接连接质谱分析仪。不难想象，仪器制造商正在努力改进现有 的仪器。
目前一种新策略正在改变常规的纳米级系统。常规的纳米级系统采用分流技术获得正确的流速，而新策略则采用微液体泵和反馈机制来调节流速。 Remco van Soest是加利福尼亚州都柏林Eksigent Technologies公司的生产经理，他强调：“我们的技术可以让你获得从50纳升/分钟至300纳升/分钟流速的液体而无需采用分流技术，并且有着 优异的重复性。”质谱分析仪通常是蛋白质组学试验中的终点，但一些生物标志物的研究仍然采用一种古老的技术进行最初的分离，这种技术就是2-D凝胶电泳技 术。实际上对于许多生物化学家来说，2-D凝胶电泳就像虚构的摇滚乐队——“Spinal Tap”一样，尽管批评家和公众都不喜欢它，但它们仍然无法被替代。
对那些不在乎工作量的研究人员来说，相比色谱技术，2-D凝胶电泳在蛋白质组学的研究中具有自身独特的优势。凝胶保留了蛋白翻译后的修饰，这对 于生物标志物研究来说非常重要，因为许多疾病会扰乱蛋白的糖基化作用或修饰作用。相比传统液相色谱，2-D凝胶电泳的分辨率要高得多，并且一次跑胶就可以 分离数千个蛋白。目前没有其它色谱技术可以达到这种分离效果，2-D凝胶电泳的分辨率简直无可匹敌。
可购买的实验支持
只要想一想生物标志物研究的复杂性，就一点不会惊讶于为何如此多药物生产公司甚至一些基础研究人员另外雇用实验人员工作。实际上，随着生物标志物不断被发现，越来越多公司开始抢占市场。他们提供全套服务，从偶尔帮助进行2-D凝胶电泳至完整的发现并验证生物标志物。
是英国NextGen Sciences公司的CEOMike Pisano表示，他们可以独立、完整地进行这项研究。就像其它公司一样，NextGen sciences公司之所以转向生物标志相关业务是为了满足客户的需求。
刚开始，NextGen Sciences公司企图做实验室自动化，但生物标志物筛选业务的上升让它有能力收购Pisano的公司（一家提供蛋白质组学研究服务——专注于蛋白纯化 服务的公司，位于密歇根州的Ann Arbor）。现在生物标志物业务已经成了集团的主营业务。Pisano指出，他们开发了临床标本蛋白定量检测，并且他们所发现的蛋白正是临床试验中制药 公司非常感兴趣的蛋白，或是在临床前期公司非常希望获得的动物模型或石蜡油包埋组织中的蛋白。”
教授Martin Latterich提到，为了获得有用结论，研究人员必须将病人分类，并将分类结果和疾病预后或选择何种治疗方式联系起来。当然，想要装备下一代临床实验室从而分析相应种类，花费肯定要超出50美元。
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1 代谢组学VS系统生物学：系 统生物学的中心任务是要针对生物系统整体（无论它是生物细胞、多细胞组织、器官还是生物整体），建立定量、普适、整体和可预测（QUIP）的认知。具体而 言，系统生物学研究就是要将给定生物系统的基因、蛋白质和代谢水平所发生的事件、相关性及其对所涉及生物过程的意义进行整体性认识。从而出现了许多的 “组”和“组学”的新概念。但是现已提出的一百多个“组”和“组学”，可以大体归纳为“基因组”、“基因组学”、“转录组”、“转录组学”、“蛋白质 组”、“蛋白质组学”、“代谢组”、“代谢组学”四个方面。显而易见，DNA、mRNA以及蛋白质的存在为生物过程的发生提供了物质基础（但这个过程有可 能不发生），而代谢物质所反映的是已经发生了的生物学事件。因此代谢组学是对一个生物系统进行全面认识的不可缺少的一部分，是全局系统生物学 （global systems biology）的重要基础，也是系统生物学的一个重要组成部分。
在现有的英文表述中，代谢组学同时存在两个不同的词汇和概念，即metabonomics和metabolomics。尽管前者多用在动物系 统而后者多用于植物和微生物系统，但这些概念的本质从他们的定义中能够得到较为细致的了解。Metabonomics的最初定义是生物系统对生理和病理刺 激以及基因改变的代谢应答的定量测定。这个定义现在可以更广泛地表述为：代谢组学是关于定量描述生物内源性代谢物质的整体及其对内因和外因变化应答规律的 科学，其中心任务包括（1）对内源性代谢物质的整体及其动态变化规律进行检测、量化和编录；（2）确定此变化规律和生物过程的有机联系。 Metabolomics存在多个定义，但其精髓是：对一个生物系统的细胞在给定时间和给定条件下所有小分子代谢物质的定量分析。因 此，metabolomics可以译作“代谢物组学”。不难看出，前者是对生物系统进行的整体和动态的认识，而后者强调分析而且是个静态的认识概念。
代谢组学属于全局系统生物学（Global systems biology）研究方法，便于对复杂体系的整体进行认识。譬如，一个正常工作的人体包括“人体”本身和与之共同进化而来且共生的消化道微生物群体（或称 菌群），孤立地研究“人体”本身的基因、转录子以及蛋白质虽然可以为人们认识人体生物学提供重要信息，但却无法提供使人体正常工作不可缺少的菌群的信息。 人体血液和尿液的代谢组却携带着包括菌群在内的每一个细胞的信息，因此代谢组学方法对研究如人体这样复杂的进化杂合体十分有效。正因如此，代谢组学已经广 泛地应用到了包括药物研发、分子生理学、分子病理学、基因功能组学、营养学、环境科学等重要领域。可以预见，这门新兴学科将应用到更为广泛的领域。
2 人类的健康和疾病的防治始终是医学的目标，而其中疾病的早期诊断又 是达到这一目标的重要环节。一些蛋白质或者降解后的片段即肽段，可以作为肿瘤等疾病的生物标志物而用于早期诊断。然而，迄今能在常规临床使用的新型生物指 标还非常少。在蛋白质组问世以后，人们将疾病早期诊断的生物指标寄望于蛋白质组的技术和由血清蛋白质组得到的数据。无数的研究小组致力于追踪那些有可能成 为疾病标记的多肽或者代谢产物，使得寻找生物标志物的工作格外繁荣。目前的常用技术中，以双向电泳和质谱最为突出，两种方法都可以用于比较正常和疾病状态 下蛋白质组分的变化情况。
小词典：
LOI（loss of imprinting）：是指 基因在胚胎发育时期就通过甲基化作用发生沉默的一种表观遗传学现象。由于印记基因是父源或母源单等位基因表达，基因表达产物量在影响该基因功能方面有重要 意义。印记基因引起疾病主要表现在两个方面，一是印记等位基因的再活化，即印记丢失（LOI）；二是印记基因的另一拷贝等位基因异常造成该基因失活，而非 印记基因是两等位基因同时失活引起疾病。
补充阅读：
基因印记：高等动物的基因组为两倍体，受精卵从双亲中各继承了一套基因组。每一个常染色体均 为双拷贝，父源和母源常染色体基因都能有均等的机会表达或受到抑制，这是孟德尔遗传定律的基本要素。上世纪90年代开始，发现了不符合这个定律的遗传现 象。某些基因呈单等位基因表达，即父源与母源的基因拷贝不能同时表达，并且，父源或母源等位基因通过某种特异的基因修饰机制，特异性地抑制另一母源或父源 染色体等位基因表达。例如：胰岛素样生长因子2基因（insulin-like growth factor 2, IGF2）只表达源自父亲的等位基因，母源等位基因被抑制。相反的例子，胰岛素样生长因子2受体基因（insulin-like growth factor 2 receptor, IGF2R）为源自父亲的等位基因不表达，只表达母源等位基因。这种现象可能是在父母受精卵形成过程中，特异性地对源自父亲或源自母亲的等位基因做一印记 使其只表达父源或母源等位基因。这种现象被称作基因印记（gene imprinting）或基因组印记（genomic imprinting）。基因印记的机制现在还不完全了解，从到目前为止的研究成果看，与DNA的甲基化、染色质构造的改变、DNA复制时机的变化以及和 非编码RNA的调节作用有关。目前，关于基因印记的研究已成为分子遗传学的一个重要领域。
小词典：
本底值：亦称环境背景值。是指在不受污染的情况下，环境组成的各要素，如大气、水体、岩石、土壤、植物、农作物、水生生物和人体组织中与环境污染有关的各种化学元素的含量及其基本的化学成份。它反映环境质量的原始状态。
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