炎症性肠病中的层黏连蛋白：既是魔鬼又是天使
2015-02-20 20:18:45   来源：   作者：  评论：0 点击：

作为基底膜构成物和上皮-间质联系中间体的层黏连蛋白（laminins，LM）是组织稳态的关键。炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一种多因素病理过程，在组织修复、炎症性肠病的固有风险-即进展为癌方面，微环境、尤其是层黏连蛋白发挥了重要作用，但对其了解尚少。
最近Spenle′教授等在PLOS one发表文章，首次表明人类炎症性肠病的结肠标本及小鼠结肠炎中LMα1及LMα5链特异性、异位性的过表达，伴核内p53同步蓄积。结合该结果，他们通过染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation Assay，ChIP）提出了一个机制：p53在启动子水平诱导LMα1表达，且在细胞转染试验中通过基因敲除证实了这一点。
为模拟人类疾病，他们在肠道尤其过表达LMα1及LMα5的转基因小鼠中通过化学处理（DSS）、结合或不结合致癌物（AOM）诱发出了结肠炎及结肠炎相关的癌。他们得出结论认为：LMα1及LMα5高表达，降低DSS诱发结肠炎的敏感性、降低促炎细胞因子。尽管尚在癌前状态，但他们发现LM在两种LM转基因小鼠中通过促进肿瘤性病变的形成而可能有助于肿瘤发生。
此外，他们的结果还表明，胞核内p53及LMα1和LMα5的相关过表达，保护组织免受炎症侵害。但在突变的情况下，相同的LM分子则有助于炎症性肠病进展为结肠炎相关的癌。本文中的转基因小鼠在研究LM根据微环境不同而调节组织修复、或促癌这一相互矛盾的作用方面是一种新型模型。炎症性肠病的早期，增强基底膜的稳定性及结构正常化可能是个有吸引力的治疗策略。

图1.人类及小鼠结肠炎中，炎性反应触发LMα1/α5的表达及核内p53蓄积。（A）LMα5及LMα1在正常粘膜（对照组）、炎症性肠病患者结肠内轻度炎性腺体、溃疡细胞体系腺体（Ulcer Associated Cell Lineage gland，UACL）周围的表达。炎症性肠病标本中LMα5的免疫着色沿结肠腺体在较深的隐窝处呈强阳性，在UACL处高表达（箭头）。LMα1则仅见于炎症性肠病标本中隐窝底部的基底膜处和UACL处，无炎症区域则无表达，杯状细胞（g）中可见非特异性免疫反应。插图：深部隐窝的较高倍。（B）对照组及DSS处理小鼠结肠冰冻切片中LMα5及LMα1的表达。（C）结肠炎性区及炎症性肠病患者UACL处上皮细胞的核为p53阳性，而周围正常隐窝的胞核则仅有少许p53阳性细胞散在于腺体内。（D）DSS处理小鼠结肠标本中p53的表达（绿色）及LMα1的表达（红色）。处理后第三天，上皮细胞内大量胞核出现p53免疫表达，而LMα1共染较弱；插图：胞核p53表达放大图。第五天时，p53阳性较弱的腺体周围可见LMα1强表达。（E）示意图总结了正常结肠粘膜（对照组）、炎症性肠病患者结肠中轻度炎症腺体及UACL周围主要类型LM的分布。注意，仅标出了上皮性基底膜的染色情况。e：上皮细胞；lp：粘膜固有层；mm：粘膜肌层；箭头：隐窝底部的异位着色及UACL周围的着色。标尺：人50μm；鼠25μm。

图2：上皮细胞中野生型p53通过结合于LAMA启动子而诱导LMα1表达。（A）HCT116细胞培养于富含LM-111及LM-511的基质中。（左）RT-qPCR定量检测内源性p53mRNA（GAPDH为基准），计算出与对照组（塑料平板）的比值。纳入的9个试验（2天者3例，3天者3例，4天者3例）计算均数±标准差。（右）不同情况下HCT116细胞中p53及actin的典型免疫沉淀结果。数据表明，底层的LM并未活化内源性p53的表达。（B）不同时间点测定转染了TP53载体后HCT116细胞内LM的mRNA表达相对值。RT-qPCR测定其转录水平（GAPDH为基准），计算与对照组载体的比值。数据表明野生型（wild-type，wt）p53选择性、进行性诱导LMα1的mRNA水平升高。（C）HCT116细胞（伊立替康处理48小时）免疫荧光染色后对细胞内LMα1进行半定量测定。注意，伊立替康处理组细胞相比未处理细胞来说，细胞内LMα1升高2.3倍（n=15）。（D）两株独立的稳定sh-TP53 HCT116细胞系及一株sh-RNA对照细胞系经伊立替康处理后LMα1 mRNA的表达。48小时后，RT-qPCR测定LMα1 mRNA的相对值（GAPDH为基准）。数据均为与未处理细胞的相对比值（n=3）。p53去除的细胞中，伊立替康无法刺激LMα1的表达。（E）转染野生型或突变型p53后，HCT116细胞中LAMA1 mRNA的相对表达。LMα1 mRNA仅在野生型p53组有活化。（F）该图中，推测p53结合模序（1-6）位于转录位点上游7kb处的LAMA1启动子区及1号内含子的5kb区。（G）染色质免疫沉淀试验。由转染了对照载体（pCMV）或TP53载体（p53）后的HCT116细胞制备染色质。交联的p53-DNA复合物在PCR对假定的p53结合位点扩增后，经IgG（阴性对照）或抗p53抗体（DO1或1801）免疫沉淀。Input组为免疫沉淀前的染色质。p53结合了7个备选的p53结合位点。*为P<0.05，**为P<0.01，***为P<0.001。

图3.LM保护组织免收炎症侵害。（A-B）结肠组织镜下观（PAS染色）及LMα1、LMα5的表达，标本分别为经DSS处理或未处理的普通小鼠、Tg-lama5或Tg-lama1小鼠。该图表明两种LM链均异位性表达于转基因动物的腺体隐窝区（箭头），而LMα1的表达因DSS处理而更加弥散了。（C）均经DSS处理的情况下，lama5及lama1转基因小鼠（黑色）相比对照组（灰色）小鼠的结肠及直肠Swiss-roll炎性评分（均数±标准差，n=5）。（D）对DSS处理的普通小鼠（灰色）及DSS处理的Tg-lama1或DSS处理的Tg-lama5小鼠（黑色）结肠远端蛋白抽提物行ELISA检测，测定其促炎细胞因子水平（均数±标准差，n=6）。数据证实细胞因子的水平与小鼠的应激有关。e：上皮细胞；lp：粘膜固有层；mm：粘膜肌层；胞核为DAPI染色。*：p<0.05；**：p<0.01。标尺：50μm。

图4：过表达LMα1的转基因小鼠中，结肠炎相关的肿瘤发生增加。（A）图示AOM/DSS及DSS的处理流程。（B）对照组及转基因小鼠，经AOM/DSS或DSS处理后形成符合异型增生及原位癌的不同类型病变。相同处理情况下，Tg-lama1小鼠相比对照组来说形成肿瘤的数量更多（AOM/DSS处理7例，*P<0.05；DSS处理者7例，*P<0.05）。（C）苏木素-伊红染色示异型增生及原位癌。病变腺体LMα1（红）、LMα5（最下行，绿）强阳性，且核内存在p53（中间一行，绿）。核染色为DAPI。e：上皮细胞；m：肌层；s：间质；箭头：基底膜区。标尺：50μm。

图5：炎症性肠病及结肠炎相关癌症中，p53在调节LM表达方面的重要作用。Caroline Spenle′教授等提出下述理论：炎症激发p53在胞核内的蓄积，这反而激活了LMα1的表达、及LMα1伴随LMα5在基底膜的沉积。炎症所致的LMα5过表达机制与p53无关。慢性炎性微环境中高表达的LMα1及LMα5，可能具有物理屏障的功能，导致如转基因小鼠所表现的那样炎症减弱。不过，慢性结肠炎后致癌背景中的LMα1及LMα5高表达可能有助于促进致癌的微环境。