从HBsAg检测技术演变说开去
2013-08-24 16:21:40   来源：37度医学网   作者：  评论：0 点击：

乙型病毒性肝炎 （乙肝） 的临床类型包括急性和慢性乙肝，与肝硬化、肝癌和肝衰竭等并发症的发生密切相关，严重危害人类健康。我国曾为乙肝的高流行区。为控制乙肝，我国自1992年开始实施新生儿乙肝疫苗免疫策略，并于2009-2011年开展对15岁以下人群乙肝疫苗的查漏补种工作。
　　据国家卫生和计划生育委员会统计，自1992-2009年，我国共有9200万人通过接种乙肝疫苗，免受乙肝病毒 （HBV） 的感染，其中预防慢性HBV感染2400万人，减少肝硬化和肝癌等引起的死亡430万人。

　　然而，最新统计数字显示，我国乙肝病毒表面抗原 （HBsAg） 携带者仍约有9300万人，且每年新发HBV感染者达10万之多。全球每年乙肝相关死亡的病例中，近半数来自中国。因此，在未来相当长时间内，乙肝及其相关疾病仍是我国面临的主要健康问题之一。

　　HBsAg检测方法的演变

　　HBsAg的发现，为我们提供了筛查HBV感染的手段。其检测方法包括放射免疫检测、酶联免疫检测、微粒子和化学发光检测体系，后者可以实现HBsAg的定量检测（检测值下限为0.05 ng/ml）。

　　HBsAg的发现 1963年，美国布隆伯格（Blumberg）发现澳大利亚抗原 （简称“澳抗”）。该抗原在后续的研究中被确认为HBV的外膜蛋白，也即我们今天所说的HBsAg。Blumberg的这一发现使人们最终发现了乙肝的病原体——HBV。

　　HBsAg检测方法的演变 HBsAg的发现，为我们提供了筛查HBV感染的手段。Blumberg最早是通过琼脂扩散法发现“澳抗”，但该法的灵敏度和特异度低，不适用于临床。1972年，美国雅培公司研发的放射免疫试剂 （AUSRIA-125） 可检测血清HBsAg，并获得美国食品与药物管理局批准，被广泛用于HBV感染的临床诊断和献血人员筛查。

　　北京大学肝病研究所在上世纪70年代末，率先研制出我国HBsAg检测试剂。我国在上世纪80年代开始对献血人员实施血清HBsAg筛查，这一措施有效降低了HBV经输血传播的风险。

　　随着技术的进步，HBsAg检测方法也逐步得到改进和提高，先后经历了基于放射免疫和酶联免疫检测方法的改进，使之在灵敏度和特异度上均有很大提高。近年，微粒子和化学发光检测体系的应用不仅实现了自动化检测，并可对血清HBsAg进行定量检测，其检测下限为0.05 ng/ml。

　　HBsAg实验室检测所面临的挑战

　　当前，血清HBsAg实验室检测所面临的首要挑战是病毒在各种选择压力下发生突变所带来的假阴性问题。

　　诱发突变的因素 诱发HBsAg抗原表位突变的因素为：① 免疫逃逸，乙肝疫苗、乙肝免疫球蛋白和机体免疫应答的选择压力等；② 耐药突变，S区基因完全位于P区之内，核苷 （酸） 类抗HBV药物的选择压力导致的P区突变，可引起S区突变。

　　基因突变影响HBsAg定量检测的准确性 有研究表明，某些点突变可使HBsAg与相应检测用抗体亲和力发生改变，从而影响HBsAg定量的准确性。

　　目前HBsAg定量作为一个判定抗病毒治疗效果和预测治疗转归的指标，在以应答指导为基础的治疗策略中得到广泛应用，如12周血清HBsAg快速下降是长效干扰素治疗有效和患者转归良好的重要预测指标之一，而S基因突变可导致HBsAg定量检测值的不准确，该问题应受到关注。

　　机体免疫应答程度影响HBsAg水平 值得强调的是，肝细胞内HBV病毒复制活跃程度并不是决定血清HBsAg水平的唯一因素，机体对HBV感染的免疫应答强弱同样影响患者的血清HBsAg水平。这在一定程度上解释了为何血清HBsAg水平更适用于以免疫调节为主的长效干扰素的临床抗病毒疗效和患者预后的判定。

　　HBsAg定量检测的局限性 HBsAg存在于3种不同形式的病毒产物：小圆球状颗粒、管状颗粒和大圆球状颗粒（Dane颗粒），其中仅Dane颗粒含有HBV DNA，是真正具有感染性的HBV颗粒。

　　由于HBsAg定量与真正反映病毒复制水平的HBV DNA定量并不存在明确的线性关系，这在核苷 （酸） 类似物的抗病毒治疗中尤应注意。该类药物通过抑制逆转录和DNA合成发挥抗病毒作用，对HBsAg的表达无直接影响，故在治疗过程中常表现为HBV DNA快速下降，并且与血清HBsAg的下降不完全平行。

　　辩证看待HBsAg阴转率的临床意义 作为治疗终点指标，HBsAg阴转甚至血清学转换无疑比e抗原的血清学转换和HBV DNA消失更接近于临床治愈，但目前治疗药物和治疗策略所获得的HBsAg阴转或血清学转换率过低。

　　基于该现实，临床抗病毒治疗与其过分强调HBsAg阴转率或血清学转换率，莫如遵循我国《慢性乙型肝炎防治指南》，现阶段将治疗目标实实在在地定在有效阻滞或减缓慢乙肝疾病进程、减少终末期肝病发病率和死亡率上。

　　HBsAg阳性患者并非均为

　　HBV感染状态

　　由于存在整合的病毒DNA片段表达和外泌HBsAg的可能性，在某些情况下，血清HBsAg阳性也不一定真正反映患者处于HBV感染状态。

　　我们的研究室分析了非肿瘤肝组织 （包括慢性HBV感染者的肝组织） 中HBV DNA整合片段的断点在HBV基因组内的分布（图）。如图所示， HBV DNA断点主要分布在DR1和DR2区域，约占52.3%，而在其他区域则呈随机分布状态。这一现象表明，整合在人类基因组上的HBV DNA有可能表达HBsAg。

　　此外，我们用雅培试剂对有HBV DNA整合的肝癌细胞系进行HBsAg检测。结果显示，在PLC-PRF-5肝癌细胞系的培养上清中HBsAg可达10.84 IU/ml，远高于HBsAg检测阳性的判定下限。该细胞中不存在游离的HBV DNA，细胞培养上清中检测到的HBsAg应是来自于整合的HBV DNA片段的表达产物。

　　由此可见，由于存在整合的病毒DNA片段表达和外泌HBsAg的可能性，在某些情况下，血清中HBsAg阳性也不一定真正反映患者处于HBV感染状态。

　　目前有关OBI的定义以及通过筛查HBsAg反映HBV感染状态还存在不确定的地方，有待进一步完善。

　　对于血清HBsAg阴性患者，如果能在其肝组织中检测到HBV cccDNA， 或在其血清中而不是在其肝组织中检测到HBV DNA，则诊断为隐匿性HBV感染的可靠性将大大提高。

　　隐匿性HBV感染实验室检测的一点思考

　　隐匿性HBV感染（OBI） 的定义

　　目前有关OBI的定义可总结为，在排除乙肝病毒（HBV）感染的急性窗口期后，主流试剂检测血清乙肝病毒表面抗原（HBsAg）阴性，但血清和 （或） 肝组织中HBV DNA阳性，且处于低水平复制状态 （HBV DNA<200 IU/ml），可伴有血清乙肝病毒表面抗体（HBsAb）、乙肝病毒e抗体（HBeAb）和 （或）乙肝病毒核心抗体（HBcAb）阳性。

　　早在1979年，人们就发现血清中仅含HBcAb 的供血者存在通过血液传播HBV的风险，进而引入隐匿性HBV感染 （OBI） 的概念。

　　随后的多项研究均提示，一些血清HBsAg阴性的患者存在HBV感染，这些患者可无任何既往HBV感染的血清学指标，或仅为HBcAb阳性。由于OBI可导致HBV经输血传播，并在合并丙型病毒性肝炎 （丙肝） 时可加重肝纤维化、肝硬化及肝癌的发生，进而受到越来越多的关注。

　　OBI的最早期定义 目前，有关OBI的定义有很多种。OBI最早的定义为，肝组织中存在可复制的HBV DNA，血清HBsAg阴性，但此定义不能排除HBsAg在HBV感染早期无法检出的情况。

　　针对此问题，有人将OBI定义为，在HBV感染的急性窗口期之外，患者血清HBsAg阴性，且HBV DNA阳性，伴或不伴有HBV抗体阳性。

　　OBI的EASL定义 2008年，由 欧洲肝脏研究学会（EASL） 召开的关于HBV隐匿性感染的国际研讨会以及在同年举行的陶尔米纳（Taormina）共识会议中将OBI定义为，当前主流试剂检测HBsAg阴性，但在血清或肝组织中HBV DNA阳性的感染状态。

　　该定义还规定了血清HBV DNA定量的临界值，即HBV DNA≤200 IU/ml。此定义排除了显性HBV感染状态下，由于S基因突变导致的HBsAg无法检出的情况。并且为了避免实时聚合酶链反应（PCR）检测的假阳性问题，建议检测至少两个不同的HBV基因区域。

　　OBI的我国定义 我国制订的《慢性乙型肝炎防治指南》中将隐匿性慢性乙肝定义为血清HBsAg 阴性，但血清和 （或） 肝组织中HBV DNA 阳性，并有慢性乙肝的临床表现，患者可伴有血清HBsAb、HBeAb和 （或） HBcAb阳性。

　　综上所述，目前有关OBI的定义可大致总结为，在排除HBV感染的急性窗口期后，主流试剂检测血清HBsAg 阴性，但血清和 （或） 肝组织中HBV DNA阳性，且处于低水平复制状态 （HBV DNA <200 IU/ml），可伴有血清HBsAb、HBeAb和 （或） HBcAb阳性。

　　OBI发生的可能机制

　　虽然存在OBI已经成为共识，但OBI患者中HBV持续低水平的复制机制仍不是很明确，可能的发生机制包括宿主免疫反应、HBV免疫复合物的形成、HBV在S区的突变、合并丙肝病毒 （HCV） 或丁肝病毒 （HDV） 感染以及HBV肝外感染。

　　宿主免疫反应 OBI通常继发于显性HBV感染，研究表明，急性乙肝在临床痊愈数年后，活化的T细胞抗病毒应答仍可持续很长时间，进而使HBV复制维持在较低水平。

　　HBV免疫复合物的形成 有研究证实，急性自限性乙肝患者中，血清中出现HBsAb后，HBsAg与HBsAb形成免疫复合物，进而可能会促成OBI的发生，但具体机制尚不清楚。

　　值得注意的是，抗原抗体复合物的存在也可能造成实验室检测中HBsAg和抗-HBs同时阳性。

　　HBV在S区的突变 一方面，Pre-S/S蛋白免疫活性部分的氨基酸替换会影响CD8+T细胞决定簇和产生HBsAb应答的B细胞决定簇，进而影响HBsAg的抗原性和HBsAb的产生，干扰HBV的清除；另一方面，Pre-S/S区的逃逸突变会导致HBsAg检测的反应性降低，导致HBsAg不能被检测出。

　　合并丙型肝炎病毒 （HCV） 或丁型肝炎病毒 （HDV） 感染 研究表明，HCV和HDV可抑制HBV的复制水平并减少HBsAg的合成。

　　HBV肝外感染 近年，多项研究发现，HBV不仅可感染肝细胞，还可在肝外的一些组织中检出HBV DNA，包括外周血单核细胞、胰腺、胆管上皮细胞、肾小球基底膜、血管、皮肤、白细胞和骨髓细胞等。但只有在肝细胞内存在适于HBV复制的肝组织特异性转录因子，其他组织并不适于HBV复制，所以肝外感染可能是OBI产生的一个因素。

　　OBI的严重性可能被夸大

　　目前OBI的诊断方法不能排除HBV完全清除但存在HBV DNA整合的情况，这造成了目前一些研究中OBI的流行情况被过度夸大。

　　肝细胞基因组内HBV DNA整合是干扰OBI诊断的一个主要因素 HBV在肝细胞内的复制是以肝细胞核内的共价闭合环状DNA（cccDNA）为模板，通过转录和逆转录合成出子代病毒的DNA。因此，反映HBV感染状态的金标准，应该是肝组织中是否存在HBV cccDNA。在现有OBI的定义中，虽强调HBV的感染状态，但却是以患者血清或肝组织内是否有HBV DNA检出作为核心指标。

　　在为诊断OBI而进行肝组织中HBV DNA检测时，不能排除检测到的HBV DNA是整合在宿主基因组内的HBV DNA片段。换言之，即使肝组织内HBV DNA检出阳性，并不一定反应HBV的复制状态。所以，目前诊断OBI的方法不能排除HBV已完全被清除但存在HBV DNA整合的情况。有研究表明，肝组织内HBV DNA整合的干扰导致目前一些研究中OBI流行情况被过度夸大。

　　例如，2008年发表在《肝脏病学杂志》（J Hepatol）的一项以肝穿组织HBV DNA检出阳性为OBI诊断依据的研究显示，在HBV感染流行率并不甚高的意大利，OBI在血清学指标全阴的健康人群中的检出率为7.3% ，这一数字在HBcAb单阳性者中达到62.5% 。

　　众所周知，HBV经血传播的感染力极强，如果健康人群中OBI的流行率如此之高，特别是在一般人群中血清HBcAb流行率高达37%的中国，行之多年的献血人员HBsAg筛查将如同虚设。事实上，献血人员HBsAg筛查已被证实为减少HBV输血性感染的行之有效的措施。

　　OBI在一些人群中的高患病率或为误诊所致 一些研究表明，OBI在HBV既往感染者 （HBcAb单阳性）和慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染患者中的流行率明显高于一般人群。目前，越来越多的证据表明，该人群过高的OBI流行率可能是因误诊所致，而OBI定义的不完善可能是造成上述假象的主要原因。

　　研究显示，在HBV既往感染者 （HBcAb单阳性）的肝组织中存在HBV DNA片段的整合，这可以很好地解释在血清抗-HBc单阳性者的肝组织中HBV DNA检出率较高的原因。

　　此外，最近有关慢性HCV感染者肝组织中HBV DNA整合的研究也支持我们的上述推测。如一项来自日本 （HBV感染低流行区） 的研究结果显示，在157例血清HBV DNA及HBsAg全阴性的丙肝患者中，54例在肝组织中检出HBV DNA的整合，检出率高达34.4%。

　　HBV和HCV有着相同的传播途径，HCV感染者发生HBV暴露史的可能性比非HCV感染者高。除了存在真正的OBI外，上述丙肝患者中的高OBI检出率，可能与该人群的肝组织存在HBV DNA整合有关。

　　检测试剂的灵敏度和特异度在一定程度上会干扰OBI诊断 传统的HBsAg检测方法为酶免疫法，不同厂家生产的检测试剂的灵敏度和特异性存在差异，这可能导致OBI漏诊和误诊。HBsAg检测试剂灵敏度低将会使一些HBsAg阳性的慢性感染者被误诊为OBI；而HBV DNA检测试剂特异性低将会使一些非感染人群被误诊为OBI。