感染性疾病之病原学诊断与常见误区
2015-02-01 18:27:24   来源：   作者：  评论：0 点击：

感染性疾病至今依旧是威胁人类健康的主要疾病。规范进行感染性疾病的诊断、治疗、预防是救治患者的基础。
虽然临床工作中，在明确病原菌之前，医生根据患者感染部位常见致病菌、严重程度以及是否存在耐药细菌感染可能性开始经验性抗感染治疗始终是救治患者的关键。但毫无疑问，无论是对后续治疗进行可能的调整还是降阶梯治疗的可行性评估，以及为该部位感染常见致病菌积累可靠的流行病学数据，病原学诊断均至关重要。
做好病原学的快速、准确诊断至少包括临床微生物标本规范采集、送检、实验室规范操作以及新诊断技术，以弥补经典培养方法的缺陷（特别是对新发感染性疾病）。其中，标本规范采集、送检无疑是关键的第一步，否则，即使先进的诊断设备、技术完成的样本鉴定结果对临床不仅毫无意义，还可能误导临床，带来不良、甚至严重后果。
以下拟对临床常见标本规范采集、送检进行归纳，并结合临床工作指出常见误区。
一、临床常见微生物标本规范采集与送检
1、下呼吸道标本采集
痰培养因其采集方便、花费较少，为临床医师常规使用。
但大量循证医学研究以及指南均指出，痰并非诊断细菌性肺炎的最佳标本，尤其是医院获得性肺炎( HAP)。痰培养结果在诊断HAP中缺乏准确性。
气管吸取物是另一类较为常见的标本，因在采样时经过正常菌群定植区域，因而结果解释难度较大。
美国感染性疾病协会( IDSA)、美国胸科医师协会( ATS)、美国疾病预防控制中心(CDC)更推荐采用血、胸腔积液、肺组织等无菌部位标本进行培养，或者支气管肺泡灌洗液、保护性毛刷获取的标本等低度污染标本进行定量或半定量培养，当菌落计数高于阈值浓度时即认为是HAP的病原菌，低于阈值浓度时则判断为定植或污染。
但有研究发现，气管吸取物涂片结果通常包括侵入性定量培养检出的微生物，因此，该诊断方法具有很好的阴性预测值，特别是近期（72 h内）未更改抗生素治疗方案的患者。不同标本的诊断阈值及敏感性、特异性见表1。到目前为止，利用肺实质定量培养进行肺炎诊断的研究尚少，我们引用的相应灵敏度和特异度指标来自一篇文献，仅供参考。

与HAP不同，IDSA和ATS于2007年共同推出的《社区获得性肺炎诊疗指南》指出：对于社区获得性肺炎( CAP)门诊患者，无需进行微生物学检查，根据患者既往用药史和基础疾病史，可直接给予大环内酯类或喹诺酮类抗菌药物治疗即可，需要住院治疗的CAP患者，应在充分评估患者基础上选择进行痰培养、血培养、军团菌尿抗原检测等。
质量好的痰标本涂片结果对病原学诊断和抗生素选择均有较好的提示作用。Roson等进行了一项针对非免疫受损的住院CAP患者的前瞻性研究显示，诊断肺炎链球菌肺炎时，质量好的痰标本涂片镜检结果对诊断的敏感度和特异度分别为57%和97%，对于流感嗜血杆菌肺炎，可高达82%和99%。
2、血培养
血培养是诊断细菌和真菌血症的金标准。然而，采集过程中常出现的错误，严重影响着其结果。
（1）采集血的最佳时间：目前，对采集血标本的最佳时间存在着一定分歧。Bennett和Beeson的研究显示，患者寒战或体温高峰来临前1 h体内细菌浓度最高，此时采血可 加血培养的阳性率。2008年发表的另一项研究结果显示，血采集时间对血培养阳性率影响不大。
综合文献研究结果，笔者认为，采集时间还应结合临床情况确定，应用抗菌药物之前采集标本，是包括血培养在内的所有微生物学诊断的原则。尽量在患者寒战或体温上升期采集，即使错过最佳采血时间，随时送检血培养的临床价值也远大于不送检。
（2）采血量：采血量是影响血培养阳性率最为重要的独立因素。大部分成人血流感染患者血液内微生物密度较低(≤1 CFU/ml)，增加血量可有效增加血培养的阳性率。Lee等2007年发表的研究显示，1套血培养( 20 ml)检测敏感度为73.2%，2套血培养(40 ml)敏感度为93. 9%，3套血培养(60 ml)敏感度为96.9 %。目前的观点认为，在不同部位采集2-3套血培养( 40-60 ml)为宜；该方法还有助于后期鉴别分离到常见皮肤污染菌（如凝固酶阴性葡萄球菌）。
3、其他标本临床检测
（1）泌尿系感染：对留置尿管的患者进行尿液微生物学评价时，切忌从尿袋内直接留取尿液，应在采样端口或在近尿道口尿管处消毒、穿刺采集，置于无菌杯或试管中送检。因尿管在拔除过程中可发生污染，不推荐对尿管尖端进行培养。对于未留置尿管的患者，应指导患者规范采集清洁中段尿：做好手卫生，用肥皂和清水彻底清洁尿道口及外阴部；不间断排尿，弃去前段尿，留取中段尿于无菌容器中。如尿标本不能在采集后30 min内进行培养，必须冷藏。
冷藏的尿标本应在24 h内进行培养。对怀疑感染者，还应同时送检尿常规，以对尿培养结果进行合理解释；参照美国CDC医疗相关性感染诊断标准，当患者尿常规白细胞酯酶和／或亚硝酸盐试纸阳性并具有泌尿系感染症状、体征时，尿培养的诊断阈值可从105 CFU/ml调整为103 CFU/ml。
（2）颅内感染：怀疑颅内感染时，需采集脑脊液标本进行微生物学诊断。须严格进行无菌操作降低污染率；采集到的脑脊液若多于1管，应送检被血污染较少的脑脊液（如第2或第3管等）；若仅收集到1管脑脊液，首先送往微生物实验室，之后再做其他检查。进行细菌培养时，脑脊液应常温保存，立即送检，不需转运培养基。如进行病毒培养，则应在4—8℃保存，如要保存48 h或更长时间，应在- 70℃储存。脑脊液标本还应同时进行离心、涂片检查。
（3）脓肿：对于闭合性脓肿，应在脓肿表面清创后，用注射器抽取脓肿内容物；或将脓肿切开引流，取脓肿壁的一部分进行培养，在厌氧运输容器中转运标本或采样后即刻接种。对开放性损伤和脓肿，应尽量擦去表面覆盖物和渗出液，以拭子用力擦拭病变基底或边缘，表浅切口感染标本不宜进行厌氧培养。伤口边缘处活检、组织培养是诊断厌氧菌、分枝杆菌和真菌的最佳方法。
二、正确理解、应用微生物检验样本送检率指标要求
1、相关送检要求
国家卫生与计划生育委员会（原“卫生部”）于2011年以来，先后颁布了《全国抗菌药物临床应用专项整治活动方案》、《抗菌药物临床应用管理办法》 。要求二级以上医院应当根据实际需要，建立临床微生物室；开展微生物培养、分离、鉴定和药物敏感试验等工作；接受限制使用级抗菌药物治疗的住院患者，抗菌药物使用前微生物检验样本送检率不低于50%等。送检的标本必须是有检出微生物种、属潜在可能的样本。
2、抗菌药物使用前微生物检验样本送检注意事项
（1）非规范采集的呼吸道标本过多：前文已经介绍了肺炎诊断的微生物证据以及采样方法；但国内目前存在的问题是忽视无菌部位标本的采集（如血培养、胸腔积液培养等），随意送检普通方法经口腔留取的痰标本，这样的标本在全部样本的构成比在相当数量的医院甚至高达70% 。如此获得的结果不仅不能区别细菌定植与感染、标本污染，更会导致误导治疗、流行病学数据不可靠，需要尽快纠正、摒除。
（2）非特异性炎症指标检测泛滥：一些医院在测算抗菌药物使用前微生物送检率时把ESR、C反应蛋白( CRP)、抗链球菌溶血素O( ASO)抗原、布氏杆菌凝集试验( BST)、肥达反应、外周血乳胶凝集试验、降钙素原( PCT)、某些病原微生物血清学诊断标志物如1，3-β-D葡聚糖检测(G试验)、半乳甘露聚糖抗原检测（GM试验）等都纳入统计范畴。这不仅误解了政策要求，更会导致诊断的不确定性以及大量资源浪费。
PCT的临床应用价值目前还有比较大的争议。与其相关的文献大多集中在CAP、菌血症、腹腔感染等方面，对其他部位细菌感染的辅助诊断价值仍需进一步研究。而且，PCT需要动态监测，其动态变化远比单次结果更重要。考虑到PCT检测的局限性（敏感性和特异性仍需要大幅提高、检测试剂的稳定性亟需提高、不能鉴定细菌种类及药敏、不能满足后续的降阶梯治疗需要、其结果仅对个体有参考而对流行性病学数据无价值等）和价格因素，还不宜将其作为发热患者常规检测项目，更不能替代血培养等无菌部位标本的细菌培养诊断方法。
另外，考虑到对诊断为重症脓毒症的患者，诊断后1 h内给予适当的抗菌药物治疗对救治患者是重要原则和改善预后的关键。而此时，尚无法获得PCT的检测结果，因此，临床上还应结合患者病情给予合理判断并开始相应治疗。
G试验和GM试验对于免疫缺陷或免疫抑制治疗（如实体器官及造血干细胞移植）等存在真菌感染高危因素患者的诊断以及为挽救这些患者生命而积极抗真菌治疗的价值得到了公认。但两者干扰因素多，对不同类型真菌感染诊断价值差异大，且需要重复检测，对不存在真菌感染风险患者的诊断价值存在争议，方法的标准化以及试剂的稳定性都需要规范，且价格较贵。因此，两者均不宜作为疑似真菌感染患者常规鉴别方法，除非患者存在真菌感染风险。
在临床标本采集一诊断环节，标本涂片染色被忽视是另一个亟待解决的问题。美国CDC关于肺炎诊断标准中，特别提到了痰涂片染色如发现吞噬细菌的白细胞占视野内白细胞比例超过5%为诊断依据之一。虽然，涂片、染色结果只能获得革兰染色阴性或阳性、球菌、杆菌、球杆菌等结果，但这些信息对于指导医生制定恰当抗感染初始方案已经足够了。
对于某些细菌含量比较低的标本，如脑脊液，为提高涂片检出率，还可以离心、甩片、染色。此外，某些部位如宫颈等可以直接刮取标本、涂片、染色。某些情况下，使用位相显微镜直接观察染色湿片可以获得意外收获，而且，还能对细菌活力进行判断，如霍乱弧菌检查。
总之，正确的微生物检验样本送检不仅可以明确病原菌，还可获得其药敏结果，以进一步指导治疗，并为细菌流行病资料积累提供可靠保障。因此，上述血清学标志物送检虽有一定的临床价值，但不能替代微生物样本培养及药敏检测。
三、临床微生物鉴定新方法展望与模式探讨
由于某些病原微生物在临床上很难培养、分离，新病原菌不断出现，临床上迫切需要不同于经典的微生物培养、鉴定方法。近年来，质谱法( MS)的快速发展为上述问题提供了可靠解决方案，如基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( MALDI-TOF-MS)和PCR结合电喷雾离子化质谱(PCR/ESI-MS)。
MALDI-TOF-MS是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，是细菌、真菌分类和鉴定的快速、可靠方法，可广泛应用于临床诊断。该方法可以极好地替代经典的微生物鉴定和分类技术，仅需要极少的样品和费用；未来将成为医学微生物菌种鉴定的标准。PCR/ESI-MS是另一种可以准确诊断细菌、真菌、病毒、分枝杆菌以及细菌特殊耐药基因、病毒突变株等的新型病原鉴定方法。与MALDI-TOF-MS 一样，也可以用于医院感染流行病学调查以及感染控制。
肽核酸荧光原位杂交( PNA-FISH)、靶向实时PCR，如GeneXpert等方法由于其特异性高且价格较低，其在微生物鉴定方面的价值已经得到广泛关注。目前，这些新技术已经在国内开始应用，如GeneXpert对于艰难梭菌的诊断等。
不难看出，上述病原鉴定方法无论是硬件需要还是技术难度，都不适宜在二级、甚至某些三级医院开展。因此，目前国内迫切需要借鉴国外微生物鉴定模式，尽快建立微生物诊断医师技术系列，形成区域化病原诊断中心，成立独立的商业化病原诊断中心等。
这样，不仅可以最大限度符合卫生经济学要求，还可保证病原鉴定的准确性、可靠性，科学地指导临床抗菌药物的应用与管理水平。二级医院宜保留对临床标本的初步处理和常见标本的涂片及相应鉴别能力，从而既符合规范常见标本的初步鉴定要求，快速指导临床经验用药，更可避免大量重复性建设及医疗资源的浪费。

文章摘自《中华内科杂志》2014年12月第53卷第12期P933-935。