"升级版"编辑器可在成年小鼠中进行基因校正并诱导癌症发生
2021-04-18 20:04:22 来源： 作者： 评论：0 点击：
关键字： 癌症
“Prime Editor(PE)”是一类新型的基因编辑工具，该技术无需依赖于双链DNA断裂或外源供体DNA模板，即可介导基因组修饰。通过prime editing guide RNA中本身存在的“模板”序列，从而实现精确的单碱基替换或小规模的插入/缺失突变。为了探究该工具在成年小鼠中的基因编辑能力，来自麻省大学医学院的Wen Xue团队进行了深入研究。相关结果发表在最近的《Nature Communications》杂志上。
此前研究发现，Cas9元件中细胞核定位信号(NLS)序列的组成和数量会影响其基因编辑效率，原始的二代PE(PE2)包含两个NLS序列，转染以及细胞定位染色成像结果显示，约60%的蛋白质存在于U2OS细胞的细胞核中，约85%的蛋白质存在于HeLa细胞的细胞核中。在此基础上，作者在C末端添加N端c-Myc NLS序列，同时保留SV40 NLS序列，结果显示：改造后的PE2能够完全定位于细胞核内，作者将其命名为PE2*。此外，作者还对PE2*的主要框架进行了改造，使其能够识别更加广泛的PAM序列。
为了研究改造后的PE2*能否提高其基因编辑效率。作者比较了HEK293T mCherry报告系统在分别转染了PE2和PE2 *之后的核苷酸转化比例。转染后3天，作者通过流式细胞术量化PE2以及PE2*的编辑效率。结果显示与PE2(9.2%至16.5%)相比，PE2 *的编辑效率提高了1.5-1.6倍(14.3%至26.4%)。在另外一个相似的报告系统中，PE2*的基因编辑效率比PE2提高了1.6-1.9倍。
在此基础上，作者研究了升级版的PE2*在矫正遗传性疾病方面的作用。对此，作者使用了一个单基因突变的疾病模型进行验证。Alpha-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)是由Serpin肽酶抑制剂家族A成员1(SERPINA1)基因突变引起的遗传性疾病。SERPINA1(PiZ等位基因)中的E342K突变(G到A)是最常见的突变，该突变会导致严重的肺脏和肝脏疾病。细胞培养实验证明， PE2 *的碱基矫正比例为6.4–15.8%，而PE2仅为1.9–9.9%。总的来说，PE2*相比PE2的基因矫正能力提高了1.6到3.4倍。最后，作者还证明了该升级版的PE2*在活体中的基因编辑能力。结果显示，PE2*能够更加高效地改变小鼠中CTNNB1 (β-catenin) 的S45F突变(C-T)，从而提高肿瘤发生的水平。而利用AAV传递，则可以起到纠正小鼠肝脏中致命性突变(SERPINA1蛋白E342K突变)的作用。
“Prime Editor(PE)”是一类新型的基因编辑工具，该技术无需依赖于双链DNA断裂或外源供体DNA模板，即可介导基因组修饰。通过prime editing guide RNA中本身存在的“模板”序列，从而实现精确的单碱基替换或小规模的插入/缺失突变。为了探究该工具在成年小鼠中的基因编辑能力，来自麻省大学医学院的Wen Xue团队进行了深入研究。相关结果发表在最近的《Nature Communications》杂志上。
此前研究发现，Cas9元件中细胞核定位信号(NLS)序列的组成和数量会影响其基因编辑效率，原始的二代PE(PE2)包含两个NLS序列，转染以及细胞定位染色成像结果显示，约60%的蛋白质存在于U2OS细胞的细胞核中，约85%的蛋白质存在于HeLa细胞的细胞核中。在此基础上，作者在C末端添加N端c-Myc NLS序列，同时保留SV40 NLS序列，结果显示：改造后的PE2能够完全定位于细胞核内，作者将其命名为PE2*。此外，作者还对PE2*的主要框架进行了改造，使其能够识别更加广泛的PAM序列。
为了研究改造后的PE2*能否提高其基因编辑效率。作者比较了HEK293T mCherry报告系统在分别转染了PE2和PE2 *之后的核苷酸转化比例。转染后3天，作者通过流式细胞术量化PE2以及PE2*的编辑效率。结果显示与PE2(9.2%至16.5%)相比，PE2 *的编辑效率提高了1.5-1.6倍(14.3%至26.4%)。在另外一个相似的报告系统中，PE2*的基因编辑效率比PE2提高了1.6-1.9倍。
在此基础上，作者研究了升级版的PE2*在矫正遗传性疾病方面的作用。对此，作者使用了一个单基因突变的疾病模型进行验证。Alpha-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)是由Serpin肽酶抑制剂家族A成员1(SERPINA1)基因突变引起的遗传性疾病。SERPINA1(PiZ等位基因)中的E342K突变(G到A)是最常见的突变，该突变会导致严重的肺脏和肝脏疾病。细胞培养实验证明， PE2 *的碱基矫正比例为6.4–15.8%，而PE2仅为1.9–9.9%。总的来说，PE2*相比PE2的基因矫正能力提高了1.6到3.4倍。最后，作者还证明了该升级版的PE2*在活体中的基因编辑能力。结果显示，PE2*能够更加高效地改变小鼠中CTNNB1 (β-catenin) 的S45F突变(C-T)，从而提高肿瘤发生的水平。而利用AAV传递，则可以起到纠正小鼠肝脏中致命性突变(SERPINA1蛋白E342K突变)的作用。
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