靶向核苷酸“抢救”因子DNPH1能够提高癌细胞对PARP抑制剂的敏感性
2021-04-15 09:26:27   来源：   作者：  评论：0 点击：

关键字： 靶向核苷酸 | DNPH1 | 癌细胞 | PARP抑制剂
BRCA1或BRCA2肿瘤抑制基因的突变使个体提高患乳腺癌和卵巢癌的风险。 在临床中，上述癌症患者往往会接受靶向聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的抑制剂治疗。 根据最近发表在《Science》杂志上的一项研究，来自英国弗朗西斯-克里克研究所的Stephen C. West团队表明：抑制DNPH1(一种消除细胞毒性核苷酸5-羟甲基-脱氧尿苷(hmdU)单磷酸的蛋白质)，可增强BRCA缺陷细胞对PARP抑制剂(PARPi)的敏感性。 进一步研究揭示，该药物的杀伤力是基于SMUG1糖基化酶对基因组hmdU的作用而完成的，并导致PARP捕获，复制叉塌陷，DNA断裂形成和细胞凋亡。 通过使用hmdU和DNPH1抑制处理，可以使对PARPi具有抗性的BRCA1缺陷细胞重新变得敏感。 由于基因组hmdU是PARPi敏感性的关键决定因素，因此靶向DNPH1为BRCA缺陷型癌症对PARPi治疗耐受性的问题提供了一种有前途的解决方案。
在该研究中，作者首先利用CRISPR技术对PAPRi敏感性的调节元件进行了筛选。通过基于慢病毒方法，向MUS81-/-细胞(一种同源重组缺陷的细胞系)中导入了CRISPR全基因组文库，然后用olaparib处理10天，该筛选手段帮助鉴定出缺失(致敏)和富集(引起耐药性)的sgRNA(gRNA)。使用MAGeCK(基于模型的全基因组CRISPR-Cas9基因敲除分析)算法对gRNA读数进行生物信息学分析，确定了调节细胞对PARPi敏感程度的几个决定因素。
筛选结果中排名最高的是DNPH1(2'-脱氧核苷5'-单磷酸N-糖苷酶，也称为RCL)，它是在多种肿瘤中过表达的c-Myc蛋白的靶标。因此科学家们认为DNPH1可能参与核苷酸的“挽救”途径，并起着防御的作用：从核苷酸库中除去修饰的或异常的核苷酸，以防止其掺入DNA中。第二种核苷酸“拯救”分子——ITPA(肌苷三磷酸酶)的破坏也使MUS81-/-细胞对olaparib敏感：通过使三磷酸脱氧肌苷去磷酸化以限制其掺入DNA中。 DNPH1和ITPA也已在先前的PARPi筛选中鉴定得到，为了验证其功能，作者使用单独的CRISPR敲除细胞系进行了二次检验。结果显示：eHAP细胞中任何一个基因的破坏都不会影响细胞的生长或生存能力，但任一基因的缺陷会使缺乏HR的MUS81-/-细胞对olaparib的治疗敏感(。这些结果表明，DNPH1和ITPA的靶核苷酸是PARPi细胞毒性潜在的内源性DNA损伤的来源。
此前研究表明，DNPH1在体外具有水解脱氧核糖核苷单磷酸(dNMP)的能力，但其体内的靶点以及生物学功能仍然未知。为了确定DNPH1的靶标，作者对WT，DNPH1-/-和ITPA-/-细胞中基因组DNA的核苷组成进行了代谢组学分析。结果显示，在ITPA-/-细胞中发现了数量更多的基因组脱氧肌苷(dI)，然而在DNPH1-/-细胞中，基因组DNA中5-羟甲基-脱氧尿苷(hmdU)发生特异性增加。 hmdU是一种细胞毒性核苷，由表观遗传调控过程中的胸腺嘧啶核苷氧化损伤或5-羟甲基-脱氧胞苷(hmdC)脱氨基引起。除此之外，作者没有观察到其他基因组核苷的显著变化。基因组hmdU的定量显示，野生型中的脱氧核糖核苷(dNs)约为5个/每一百万碱基，DNPH1-/-细胞中的脱氧核糖核苷(dNs)约为15个/每百万碱基。因为DNPH1水解dNMP，所以这些结果表明DNPH1作用于核苷酸池中的hmdU单磷酸(hmdUMP)，从而限制其向基因组DNA的掺入。通过对核苷酸库的分析，作者发现，用hmdU处理的DNPH1-/-细胞中的hmdUMP与WT细胞相比增加了10倍，而基因组中的hmdU修饰则仅仅增加了大约三倍。这些结果表明，DNPH1作用于hmdUMP，以限制其掺入DNA。