用于预防人类乳头状瘤病毒相关恶性肿瘤的病毒样颗粒
2013-11-20 21:05:08   来源：   作者：  评论：0 点击：

用于预防人类乳头状瘤病毒相关恶性肿瘤的病毒样颗粒
用于预防人类乳头状瘤病毒相关恶性肿瘤的病毒样颗粒
Joshua W Wang和 Richard BS Roden
Expert Rev. Vaccines 12⑵，129-141(2013)
与以肽或蛋白质为基础的疫苗、裸DNA载体和甚至传统的减毒或灭活疫苗相比，病毒样颗粒（VLPs）是一个具有吸引力的疫苗平台，例如它们提供了安全的组合、便于生产，而且它们既具有高密度B细胞表位，又具有细胞内呈递的T细胞表位，二者各自地诱导强有力的体液的和细胞的免疫反应。事实上，通过主要的衣壳抗原L1在酵母（美国新泽西州，默克公司的Gardasil疫苗）或昆虫细胞（英国伦敦，葛兰素史克公司的Cervax疫苗）中的重组表达，基于VLP生产的人类乳头状瘤病毒（HPV）疫苗，已获准用于预防它们所针对基因型相关的子宫颈、肛门与生殖器的HPV感染。然而，这两种HPV疫苗未被证明能有效地治疗已存在的感染，所以要努力地继续开发治疗性HPV疫苗。此外，目前的HPV L1-VLP疫苗只提供了基因型受限的保护，还需要有扩大针对12个或更多的的致癌性HPV基因型的高度多价配方。这就增加了疫苗生产的复杂性和成本。发展中国家里高度的疾病负载和接受筛查的缺乏，已促使它们努力地开发更实惠、能诱导更广泛的保护覆盖面、并提供针对HPV相关恶性肿瘤治疗性覆盖的第二代HPV疫苗。鉴于以往使用L1-VLP载体疫苗预防HPV的成功，VLPs也已被用于预防和治疗两种目的，许多二代HPV和非HPV疫苗候选抗原采用VLPs作为平台。在这篇评述中，作者们把注意力集中于研究者们报告的如何设计VLP疫苗方面，梳理了这些工作所取得的进展和面临的困难。
VLP疫苗系统的状况
据估计，全世界所有癌症的16．1%是已知的传染性病原体引发的［1］。一定的传染性病原体可引发癌症的知识，驱动了预防性疫苗的开发和发放许可证。两个小DNA病毒HBV（人乙型肝炎病毒）和HPV引发各占世界癌症的5%。通过接种疫苗预防癌症的概念，已由20世纪80年代后期开始的近30年来，广泛使用默克公司(美国新泽西州)的Recombivax和葛兰素史克公司（英国伦敦）的Engerix-B两种重组乙型肝炎疫苗,得到了证明。研制HPV疫苗，也采用了同样的方法，在21世纪的首个10年的后期，开始使用默克公司的Gardasil(佳达修)和葛兰素史克公司的Cervarix(卉妍康)两种HPV疫苗。这两种HPV疫苗显著有效地保护健康个人至少10年免于新的感染，并表现了优秀的安全性［2-5］。HBV和HPV两种疫苗，均是基于重组病毒样颗粒（VLPs）的［6-9］。由于两种疫苗的使用，HBV和HPV的相关疾病成功地减少，且安全性优秀，使VLPs在疫苗开发领域中越来越受到重视。
VLPs提供了超过其他类型疫苗平台的几个有利条件。首先，VLPs与活的或减毒的疫苗相比，是非常地安全。许多病毒的结构蛋白在单独表达时，能模拟它们各自的天然病毒颗粒结构，自我组装进具有高度免疫原性的VLPs。然而，VLPs缺乏感染性的病毒基因组，而且，这种差异与它们传统的相应疫苗如减毒或灭活病毒会复归感染状态相比，使得VLPs疫苗候选抗原更为安全［10］。这还可以解决疫苗生产中的许多问题，如病毒一般在哺乳动物的细胞系中制备，而VLPs可以在细菌、酵母或昆虫细胞中生产，极大地方便生产的扩大，并减少对安全的担忧。第二，与组装肽疫苗相比，VLPs疫苗具有高度的免疫原性；往往在没有佐剂的情况下，大多数VLPS能诱导产生很高的中和抗体滴度，而且，这些反应具有持久性。这主要是由于VLPs具有高度有序的结构，使它可反复地递呈抗原表位，强有力地激活B细胞，或使树突状细胞（DCs）激发细胞介导免疫［11-13］。第三，应用分子生物学技术，还可以把VLPs作为防止其他传染病的异种抗原的支架。虽然，这是一种有前途的方法，但其在临床中仍未被证实。不过，这种方法的潜力，已导致大量的疫苗研究团队继续地把他们的努力集中在VLP展示平台上，使用或是细菌的、植物的或是哺乳动物的病毒。第四，VLPs在许多情况下，能够突破B细胞的耐受性，而这可能为诱导对自身抗原的抗体提供一种方法，如通过主动的接种疫苗，而不是使用单克隆抗体的被动免疫治疗，来阻止自身抗原的有害作用［7］。第五，VLPs被DCs摄取，并可沿着MHC（主要组织相容性复合体）Ⅰ类分子通道递呈［8］。这就为治疗性T细胞表位连接VLP，和为开发治疗先前存在并已确诊的传染病及癌症的疫苗，提供了一个途径。关于HPV的情况，我们评术的重点是VLPs，本讨论在提及近期用VLP平台研制预防和治疗的第二代具有广泛保护性的HPV疫苗成功和失败之前，将首先对HPV疫苗领域作一简要的概述。对包含异种抗原表位的HPV VLPs作为防治其他疾病的平台一直在进行测试，以及将讨论使用这种方法的技术考虑和关键的困难。
HPV的生物学概述
HPVs属于无包膜病毒一族，具有一个大约直径60纳米的T=7d（译注：T为三角剖分数，d表示右旋）的二十面体衣壳。在衣壳内是一个双链、共价闭合、环状DNA基因组，约有7800碱基对。HPV基因组编码6个早期基因（E1、E2、E4、E5、E6和E7）和2个包含在病毒衣壳结构内的晚期基因（L1和L2）。L1是主要的衣壳抗原，衣壳由72个L1五聚体自我组装形成的（称为衣壳体）。另一个衣壳蛋白L2，其在衣壳中与L1显示的比例有1：5那么高，即L2为1，L1为5 ——更准确地说，每一个HPV颗粒中有72个L2蛋白——虽然曾有描述低至1：30的。了解HPV的病毒学和其在肿瘤发生中的作用，对促进第二代HPV疫苗的开发是重要的；然而，由于受篇幅所限，所以将不在本文中全面详细地讨论（见［14，16］综述）。简要地说，性交期间，宫颈上皮可能会经受轻微的磨损，这就可引起HPV感染它们的宿主细胞——子宫颈的基底未分化角蛋白形成细胞。病毒在基底细胞中，其早期基因被表达，以及基因组被复制，大约每个细胞中病毒的一个游离基因可有102个拷贝［14］。HPV在基底细胞中的感染确立以后，通过被感染基底细胞的分化，触发了HPV晚期基因的表达程序，随着细胞的分裂而留在基底膜。晚期基因的表达是与病毒基因组无性过度复制、E4蛋白、衣壳基因表达和病毒颗粒形成相关联的。在肿瘤性转化期间，HPV的DNA通常整合进宿主细胞基因组并失去其游离体形态。整合通常导致E2基因的破坏和晚期基因（即L1和L2）表达的丧失。E2激活驱动E6和E7的表达，这对保持转化状态是必需的。E6致弱TP3（译注：患者具肿瘤抑制功能的基因），而E7使成视网膜细胞瘤基因失活（译注：此处原文retinoblastoma后宜有gene,一种抗癌基因）（在许多生长调控通路中，受这两个病毒癌基因蛋白的影响最为突出），它们一起的协同作用导致细胞基因组的不稳定，接着细胞转化和失去分化能力，并促进鳞状上皮细胞的损害而成为转移性病灶［10-14］。
HPV具有对皮肤和粘膜组织区不同组织嗜性的100多个基因型［17］。大多数HPV感染引发良性和自限性皮肤肿瘤（如足底疣和平面疣）或生殖器疣。然而，某些“高风险”或“致癌”类型的HPV，是引发宫颈癌、还有肛门、阴道、外阴、阴茎和口咽（头和颈）区的一类癌症的必然病原。绝大多数的宫颈癌（85%-99%）负载有HPV［1，18］，虽然HPV是一种必然病原，但幸运的是大多数HPV感染不会引发癌症，这是因为它们受宿主免疫系统的控制或消除［19，20］。超过十多个的高风险型HPV倾向于引发癌症；而到目前为止HPV16是引发癌症最多的一型，50%的宫颈癌是由它引发的，HPV18引发其余的20%宫颈癌，表明它们各自引发的癌症相对来说所占部分不大。值得注意的是，除了子宫颈癌以外的患癌部位，HPV16引发的癌症更占多数，它在引发其他与HPV相关的肛门与生殖器及头颈部癌症所占比例要超过90%［14］。正如前面提到的，两种预防性疫苗已被批准作预防HPV的持续感染、HPV相关恶性肿瘤的前体、高风险的宫颈上皮内瘤样病变（CIN）、外阴上皮内瘤变、阴道上皮内瘤变和肛门上皮内瘤变的基本疫苗。临床试验也证明佳达修（Gardasil）疫苗预防生殖器疣是有效的［21］。这两用种疫苗用于预防至少已有十年，疫苗防止的是引发宫颈癌癌前病变相关的HPV16型和HPV18型感染［2-5，18］。数据还表明，接种HPV疫苗可以防止其他与HPV相关的阴道、外阴和肛门的肿瘤形成以及口腔清洗液中检出HPV16［22］。
目前已批准的HPV疫苗及它们的局限性
佳达修和卉妍康（Cervarix）是基于VLP技术的两种疫苗，分别由HPV病毒的主要衣壳蛋白L1在酵母和昆虫细胞中表达而诱导被接种者产生免疫力的。L1能够自我组装形成免疫原性而无感染性的VLPs，它能够诱导像天然病毒颗粒所诱导产生同样高的中和抗体滴度［23］。接种以VLPs为基础的L1疫苗，使免疫系统产生的抗体滴度更高于该病毒自然感染后所产生的抗体滴度100倍［2-4，9，24-27］。此外，动物接种L1-VLP免疫后的血清给幼稚动物注射的被动抗体转移研究，致使动物获得了保护［24，28，29］。这些研究强有力地表明，HPV VLP诱导的保护是由体液免疫介导的，但固有免疫和细胞介导免疫的作用不能被排除。
尽管近期批准的两种商品疫苗可于利用，但宫颈癌仍然是全球妇女中第三大最常见的杀手，其原因有几个（表1）［30］。第一，可利用的这两种疫苗的时间不长，以致未能影响宫颈癌的发病率，这是因为这种癌症的演变过程超过十年，因此其对癌症发病率和相关的死亡将要在采用后20年到30年才最有可能体会到。第二，疫苗接种方案没有推广到许多世界低收入地区，部分地反映了疫苗的价格相对地高。事实上，宫颈癌发生在发展中国家要占到全球的85%，大多数发展中国家还无力负担这种疫苗的费用（虽然，已引入分层定价，但在美国完整的免疫程序费用要达360美元）［31，32］。不过，正在努力开展通用疫苗的区域生产，这将可能会降低成本和大大地提高疫苗的购买能力。
现在批准使用的HPV疫苗的保护作用受到病毒基因型的限制，也就是说，这种疫苗赋予的主要是疫苗中VLPs所诱导针对的基因型的保护力［8，33，34］。虽然有一些抗最密切相关类型交叉保护作用的临床证据，但所检测到的交叉保护抗体水平往往非常低或者没有，而且这样一种交叉免疫力是否能够长期持续存在也是不清楚的［32，35，36］。目前批准的两种HPV L1-VLP疫苗是以两个致癌基因型HPV16和HPV18为基础制造的，这两个基因型HPV所引发的宫颈癌约占全部宫颈癌病例的70%。佳达修也可防止由HPV6和HPV11所引发的良性生殖器疣。然而，接种疫苗的个体，防止其余十多个致癌基因型中大多数的保护力是微弱的或无效的，这些基因型引发的宫颈癌约占全部宫颈癌病例的30%［14，19，37，38］。此外，这两种疫苗不能防止皮肤基因型HPV1和HPV2所引发的良性皮肤疣如足底疣和寻常疣。为了解决免疫力受基因型限制的问题，将研制更高效价L1-VLP疫苗以达到广泛的保护覆盖面［39］。事实上，默克公司研制的九价疫苗（译注：包含6、11、16、18、31、33、45、52、58九个基因型）在临床试验中已取得了进展，它将可能拓宽防治其他致癌HPV基因型的效能。然而，这是一种复杂和昂贵的方法，可能难以在低成本状况下生产［33］。因此，除了治疗性疫苗以外，仍然有需要开发第二代HPV疫苗，这种疫苗既能购买得起，又能提供对广泛覆盖不同致癌的和良性的HPV基因型的保护作用。
表1．目前批准使用的人乳头状瘤疫苗——佳达修和卉妍康表现的局限性（略）

扩展HPV疫苗的覆盖面，把HPV L2作为一个替代的候选基因
L2是构成HPV衣壳的另一种蛋白质，其对乳头状瘤病毒（PV）的感染是必须的［40，41］。鉴于其存在于衣壳中，L2就被推测也可用作HPV预防接种疫苗的一种抗原。使用兔和牛PV模型的初始研究表明，同源L2蛋白通过在细菌中重组表达，提供了抗黏膜和皮肤部位PV实验人工感染的保护，并诱导了低滴度的中和抗体［28，42-45］。进一步的研究表明，在L2 N端的11-88位氨基酸区域上有一些交叉中和表位，它作为单一抗原提供了广泛保护的潜力［46-51］。这些有创意研究的一个局限，是这些动物的PV模型不能详细地分析HPV基因型之间的血清学关系［52］。然而，这个问题随着HPV的假病毒颗粒（PsV）技术的开发，已在很大程度上得到了解决［53，55］。简言之，HPV PsV含有模拟天然HPV颗粒的外层衣壳结构，但不是病毒的基因组，它们还含有一个报告质粒如绿色荧光蛋白（GFP）或荧
光素酶，报告质粒的表达显示“感染”的成功。重要的是，这些PsVs可用于小鼠阴道内或皮下的人工感染［55］，而且，使用PsV疫苗接种的一些研究是与更早的动物PV研究相一致的。这也可以用“准病毒颗粒”做，“准病毒颗粒”含有牛或棉尾兔PV（CRPV）基因组，这些PV基因组内包含HPV的衣壳蛋白，提供了一个可以测量的表型（如分别在兔疣或小鼠成纤维细胞中局灶性的转化）［56］。使用这些HPV假病毒颗粒的研究表明，对L2的抗血清可以具有医学显著性的交叉中和一大批多样化HPV基因型［57-60］。具有单一L2表位的疫苗接种以后，它的血清可交叉中和广泛范围的HPV基因型，提供了抗多种HPV基因型的保护作用，是与目前的L1-VLP疫苗有重要区别的一种疫苗，因为这表明研制由L2诱导的一种简单的泛HPV预防性疫苗的可能性。L2疫苗可在细菌中生产，一个简单的、廉价的和有良好特性的系统，并可提供广泛的免疫力，尽管其产生的中和抗体水平比L1-VLP低2个数量级。在一个低成本细菌表达系统中，一种单一的能产生广泛保护力的抗原的生产，展现了一种对高度多价L1-VLP疫苗的有吸引力的替代生产方法。然而，由于它与L1-VLP相比免疫原性弱，在以L2为基础的疫苗开发中的一个关键困难，是把这些具有广泛交叉中和作用的L2表位有效地展示给免疫系统，以触发高滴度、高亲和力和持久的中和抗体反应。
HPV疫苗中使用L2的困难
L2在HPV VLP的形成中是不需要的，但其可与L1共同组装进VLPs。因此，最初的一些研究试图通过在昆虫细胞中纯化L1/L2-VLPs来拓展保护力用于免疫接种［61］。令人失望的是，这种方法没有成功，在用L1/L2-VLPS接种免疫的动物中，L2的抗体反应不是缺乏就是非常的次于L1［61］。在昆虫细胞中产生的每个L1/L2-VLPs中，与含有72个L2拷贝的预期不同，大约只含有12个L2拷贝［62］。这可能部分地这样解释，在昆虫细胞中产生L1/L2-VLP的状态下，L2处于次要地位，免疫反应就会倾向于数量更多和排列顺序更前的L1表位。然而，自然感染时触发L1的特异反应，而对L2的反应不显著，这表明L2在L1/L2-VLPs中的低含量在L2反应缺乏中不是主要的原因。不同的是，体外的数据表明，病毒感染过程开始之前，L2一直隐藏在病毒衣壳内［14，40］，只有当病毒颗粒在体外结合细胞外层基质或在体内结合基底膜细胞时L2才出现。
病毒与细胞结合以后，经历了一系列的构象变化，L2的N端暴露在衣壳的表面上（图1）［6，29，63-65］。L2的N端含有一个弗林蛋白酶的裂解位点，因此它对被细胞的弗林蛋白酶的一个单次切割是敏感的，切割移除了L2的保守的带正电荷的氨基端，而L2这种被弗林蛋白酶的裂解对感染是必不可少的。经过这些变化，使在衣壳表面上的L2基因N端的几个广泛交叉性的中和抗原表位得以显示，包括被交叉中和单抗RG-1确认的残基17-36［40，49，65，66］。目前，L1的构象如何改变、和/或如何裂解L2并与基底角蛋白形成细胞上的次级受体结合以促进病毒进入细胞，还是不清楚的［61，63，67］。不过，L2表位在病毒进入细胞以前的短暂接触受体表明是需要的，这是为了使这种广泛交叉保护性表位躲避免疫系统。在衣壳环境中L2的隐形和相对于L1的次要性，可能有助于解释改变这些表位进化压力的缺乏，从而导致这些广泛交叉表位的保持。L2中和表位的稳定，也表明了一种进化约束，可能反映了在感染期与一个进入细胞的因子结合的一种作用。因此，几十年来L2疫苗面临的困难，是要找到诱导和保持针对L2表位的保护性抗体水平的一些方法。
图1．宫颈上皮被HPV感染的模式（由Day等绘制），（图略），其中的说明如下：HPV到达基底膜上，HPV与基底膜上的硫酸肝素蛋白聚糖结合，衣壳被诱导产生一系列的构象变化（这里以不同颜色围绕病毒颗粒衣壳表示），最终导致L2小衣壳蛋白的短暂裸露。裸露的L2被弗林蛋白酶裂解后的病毒颗粒，被基底上皮细胞通过一个未知的二级受体接纳，而开始细胞的HPV感染。HPV，人类乳头状瘤病毒；L2-exposed HPV，裸露L2的HPV；Furin-cleaved HPV, L2被弗林蛋白酶裂解后的HPV；HSPG，硫酸肝素蛋白聚糖；Uknown secondary receptor,未知的二级受体。
改进基于L2疫苗的方法
HPV L1-VLP疫苗表达L2
为了尽可能地克服HPV L1疫苗中L1的支配地位，采取提高L2在衣壳表面的表达密度，几个研究团队已通过把L2中和表位插入到HPV L1-VLPs或牛PV 1型L1-VLPs的具有免疫优势的L1-中和表位中，产生嵌合的HPV VLPs［68-70］。这个概念正在促进在L1上展示L2表位，L2表位裸露的理论量将增加约5倍，从估计的72个增加到360个。而且，L2表位将不再被埋没，L1的保护作用也可能被保留。接种使用这种方法制造的疫苗研究，已报告了通过ELISA检测到L2-特异抗体的存在。然而，HPV血清学情况中的ELISA检测已受到了非议，认为高估了HPV L2可产生的保护性抗体量，因为，HPV包含的L2区域可产生非中和抗体。因此，HPV的PsV在体外中和试验中，被用于测定HPV的特异中和抗体。大多数用这种方法的研究显示，除了高滴度的L1特异交叉中和抗体反应以外，有一个低的但可以检测到的L2特异交叉中和抗体的量。［68，69，71］。虽然，这些研究表明把L2表位放置进L1表位的免疫优势环区中，诱导了一种L2特异的交叉中和反应，但其对抗体的亲和力和持续性仍有待评估。
把L2展示在L1衣壳蛋白亚单位中（由5个L1蛋白和VLPs的构建区块组成），可能也是一种策略。Garcea和他的同事们证明，通过分别删除L1的N端和C端的9个和26个氨基酸，L1可容易地形成衣壳蛋白亚单位（由5个L1蛋白组成），而不是完整的VLPs［72］。有吸引力的是，像L1-VLP、L1衣壳蛋白亚单位（从此处起缩写为L1△）保留了诱导类型限制中和抗体的能力，尽管其产生的抗体滴度稍低［59，72］。利用L1△作为L2表位交叉呈递的一个平台是可能的，可以是克服L2表位隐藏在正常的L1/L2-VLPs中问题的一个办法。此外，在细菌中可容易地制造大量的L1△。这种疫苗的展示设计和其随后的生产方法，将可能解决HPV L1-VLP制作的成本以及L2表位的呈递两方面的问题。
我们的团队，先前通过融合5种不同HPV L2的11-88氨基酸区域（HPV 1、5、6、16、18型）和在细菌中表达这个多聚体，也开发了一个具有广泛保护性的L2-肽疫苗候选抗原（L211-88X5）。虽然它在体内能具有抗众多HPV基因型的广泛保护力，但L211-88X5仍然比L1-VLP疫苗在体内产生的中和抗体滴度数据较低［58］。HPV VLPs可直接地激活树突状细胞（DCs），因此，它有可能作为一种佐剂。这样，如果把我们的L211-88X5与已批准的HPV疫苗结合使用来扩展保护范围，同时提高L2抗体滴度和拓宽疫苗覆盖面，就是一个可能的方法。为了测试这一假说，我们对L211-88X5蛋白与L1-VLP（Cervarix）或L1△的混合物进行了研究。用HPV16所做的中和试验数据显示，L211-88X5-Cervarix混合物与单独的Cervarix比较是相当的，而在L1△存在的情况下的抗体滴度没有改善。这两个观测表明，当L1-VLPs或L1△与L2-肽疫苗混合时，L1特异性和L2特异性反应活动实质上是独立的［59］，而且，L2表位可能需要直接地展示在VLPs的表面上，而不是与它们混合，才能加强这种反应。
在另一个研究中，把3种不同的高风险HPV基因型（HPV 18、31和45）L2的13-47位残基串联地融合到HPV 16 L1△的C端，形成疫苗候选抗原HPV16L1△-L2×3；为了后续下游蛋白的纯化，该候选抗原被在细菌中表达，并用谷胱甘肽S-转移酶标记［73］。以
HPV16L1△或HPV16L1△-L2×3，和明矾及单磷酸脂A接种，诱导了类似L1特异的保护性反应，但对L213-47×3融合肽的反应弱，表明需要把这种表位在L1衣壳蛋白亚基结构的免疫优势表位中显示。
非HPV VLPs显示L2
由于L2在L1VLP的免疫优势表位中的显示，诱导了L2-特异的抗体反应，这种反应是强劲的，但仍然比L1-特异性滴度低许多，另外的一些科学家选择了使用非HPV VLPs显示L2中和表位（表2）。非HPV VLPs显示L2表位的潜力，首次由Palmer等证明，他们创建了包含棉尾兔乳头状瘤病毒（CRPV）或兔口腔乳头状瘤病毒（ROPVs）L2肽的94-122残基区的重组烟草花叶病毒颗粒［74］。接种这种重组病毒颗粒的研究表明，对同源病毒的人工感染得到了有效的保护。更重要的是，由于CRPV和ROPV是远亲关系，作者们强调重组烟草花叶病毒-ROPV，与R1B1佐剂的接种，产生了一个弱的但可以测定的抗皮肤CRPV人工感染的交叉保护反应，这进一步地证实PVs中L2的交叉中和能力。Cerovsk等在最近的研究中，使用HPV L2代替动物的PVs，利用重组DNA技术把HPV L2 108-120残基区的DNA融合到表达马铃薯X病毒（PVX）衣壳蛋白的植物病毒载体的N-或C-端［75］。从理论上来说，植物中的这种病毒载体表达，将会产生在衣壳蛋白的N-端或C-端带有HPV L2的PVX衣壳蛋白（PVXCP）VLPs。该研究显示，只有把HPV L2108-120融合在PVXCP的N-端（L2108-120-PVXCP）才可以得到表达。随后，通过皮下注射给小鼠接种L2108-120-PVXCP，还通过给小鼠文身以便管理，接着对接种小鼠的抗血清用ELISA的分析表明L2-VLP方法是能够诱导产生L2-特异性抗体的。不过，该研究不能测试中和抗体以与L1-VLP比较。尽管如此，这两项研究表明，使用一种非HPV VLP来显示L2的可能性，虽然，在优化显示中依然存在着困难。两项研究的另一个亮点，是行之有效的烟草植物蛋白表达系统，产生了显示L2的VLPs。这种方法，具有超过目前已经批准的VLP疫苗制造方法的几个优点，因为植物是便宜的并容易生长大量的生物量，以及最重要的是所表达的蛋白质疫苗，通常不会受到细菌或动物病原体毒素可能的污染［76］。
Chackerian团队，还使用噬菌体VLPs来生产一种泛-HPV VLP疫苗，他们以利用一种RNA噬菌体PP7为手段，在PP7衣壳蛋白环的表面上显示广泛的中和L2表位（17-31残基区）［77，78］。最初的研究集中于创建诱导自HPV16和HPV45序列的两个L2-PP7 VLPs。采用不完全弗氏佐剂的疫苗接种研究，表明了实质性的交叉保护作用——例如，接种HPV16L2PP7的小鼠与单独的PP7VLP相比，具有抗HPV45 PsV阴道人工感染的显著保护作用，尽管不是彻底的［78］。随后，同一团队在另一研究中，共研制了8个不同的L2-PP7 VLPs，各自显示其中一个HPV基因型的L2的17-31残基区（HPV 1、5、6、11、16、18、45和58）［77］。这些被选择的高和低风险HPV基因型，是因为推测它们的表现是与医学相关HPV基因型中的常见成员。随后，使用这些不同基因型的PsV和在L2-PP7中不包含其L2的HPV31，进行阴道和皮肤的人工感染。总之，结果表明，接种一种包含全部8种基因型的L2-PP7 VLPs混合物的小鼠，展现了最高的保护程度。接种这些L2-PP7混合物的小鼠，对HPV31 PsV的人工感染也得到了保护，突出地表现了实质性的交叉保护作用。这个系统具有几个有用的特性。第一，PP7在细菌中确实可达到很高水平的表达。第二，在他们的研究中，经过两轮接种足以引发保护作用。第三，L2-PP7混合物疫苗不需要佐剂，因为PP7颗粒带有单链RNA，它可潜在地作为一种内源性佐剂，来激活TCR-7或8（译注：Toll样受体7或8）的信号［77］。总之，这种结果表明了噬菌体方法作为一种泛-HPV疫苗所具有的潜力。这将是有吸引力的，在未来接种L2-PP7和其他方法的比较研究中，可以考查L2表位特异性中和抗体反应的持久性和亲和力。
非哺乳动物VLPs，例如腺伴随病毒样颗粒（AAVLPs）也已被探索作为显示L2的平台。AAVLPs对异种HPV L2的显示是一个有前途的平台，因为这种病毒衣壳尽管在其序列中插入外源肽表位仍是能够有效地自我组装的。Nieto等在一个最近的初步研究中，探索AAVLPs的潜力，产生了由显示HPV16和31的L2的17-36残基区的AAVLPs制成的预防性疫苗［79］。这个方法表明兔子和小鼠二者的血清具有交叉中和作用。然而，需要一种佐剂来引发交叉中和血清的高滴度，而这种反应的持续时间仍不知道。
表2．显示L2的基于VLP的预防性HPV疫苗概要（略)
治疗性的基于VLP的HPV疫苗
治疗性HPV疫苗的基本原理
子宫颈抹片筛查和干预在宫颈癌的控制中是一个行之有效的策略，通过初次筛查的人群在三年内的宫颈癌发病率可下降60%-90%。当广泛地使用预防性HPV疫苗，而且证明作为减少宫颈癌发病率的措施是有效的，这将可能对筛查服务的需要/间隔或开发治疗方法例如治疗性疫苗产生影响。然而，目前HPV的感染和其相关的疾病很普遍，治疗性疫苗对那些目前已患HPV疾病的人仍然是需要的，并可加快降低癌症的发病率。况且，许多国家中接种疫苗和细胞学筛查的实施是很不完善的。由于，在宫颈癌筛查一线HPV DNA测试方法的可能组合的出现，数百万感染个体将会确诊也加剧了对治疗性疫苗的需求。HPV感染患者在他们清除感染或发展为高风险肿瘤之前必须不断地筛查，高风险肿瘤则应进行手术治疗。高风险肿瘤的手术治疗，伴有显著的副作用和高昂的费用，而对非宫颈癌疾病则无影响。因此，治疗性疫苗对这些患者可能是有帮助的。目前，批准用于预防的HPV L1-VLP疫苗（以及到目前为止讨论过的各种L2策略）很少有或根本没有治疗作用［25］。对正患有非宫颈高风险肿瘤和仍然普遍的HPV相关癌症，新的更有效的治疗方法是迫切需要的［33］。在这种病毒的生命周期中，L1和L2衣壳蛋白可检测的表达，仅出现在被感染的角蛋白形成细胞的分化晚期。因此，无论是宫颈癌细胞或是附着在基底膜上的已感染的基底细胞，均不表达衣壳蛋白。其结果是，HPV的早期基因更适宜于作为免疫性治疗的靶标。E1和E2是可能的候选基因，但它们往往在癌中不表达。E5非常小而且免疫原性弱，E4是更晚期的蛋白且在基底细胞中无法检测。与此相反，E6和E7在所有HPV感染细胞中均得到表达，而且在癌细胞中的浓度被上调，因此，通常认为它们是免疫性治疗的合理靶标。E6和E7，在众多的HPV治疗性接种疫苗策略包括肽、蛋白质、活载体、DNA和全细胞为基础的方法中，已被用作靶标。由于受到篇幅的限制，我们的讨论只集中于使用基于VLP治疗性疫苗方法的一些工作。这是一种有吸引力的方法，它可能兼顾预防和治疗两方面的效果。对于其他的治疗性策略，读者可直接地参阅［81，82］。
用于治疗性疫苗的嵌合VLPs
对于宫颈癌的常规疗法，因为它不是直接针对这种病毒的，所以通常是侵入性的和有毒性的。因此，抗宫颈癌的治疗性疫苗的应用是有吸引力的，因为引入的这种方法具有非侵入的可能性，它通过诱导CD8细胞毒性T-淋巴细胞（CTL）反应，直接地针对HPV感染的细胞，从而减少了潜在的副作用。事实上，大多数HPV感染是被免疫系统自然清除的，但在免疫抑制或者那些疾病更晚期的患者中则变得往往很少被克服。HPV E6和E7肽序列包含几个T细胞的抗原表位，可诱发一种抗肿瘤CTL反应［82-84］。然而，由自然感染诱导的T细胞反应通常是很低或不能检测的，这可能反映了这种感染的局部性和病毒的免疫逃避机制，以及表明接种疫苗可能提高E6/E7的特异性免疫反应。如前所述，HPV VLPs可直接地激活DCs，尽管HPV VLPs是一种外源性抗原，DCs仍可通过假感染细胞提供MHC Ⅰ类呈递［12，85］。因此，VLPs除了诱导产生高抗体滴度以外，还具有容易诱发细胞介导免疫的特性。
利用VLPs的一些有利条件，许多团队试图通过形成嵌合HPV VLPs（cVLPs）来提高E6/E7的T细胞反应，在cVLPs中HPV E6、E7的T细胞的表位抗原中，或与HPV L1-VLP的C-端或与HPV L1/L2-VLPs的C-端融合。因此，嵌合的VLPS像一个“呈递工具”那样，为把HPV非结构蛋白的外加抗原表位呈递进靶细胞而进入MHC Ⅰ类呈递通道。E7与VLPs中L1的C-端融合提供了一个强劲的特异性CTL反应。然而，与L1融合的E7多肽的大小受到显著的限制，这导致cVLP在产生之前受到损失。相反，把E7与L1/L2E7-cVLPs中的L2融合，具有不破坏组装更大融合的更好耐受性，我们并注意到L2对病毒的感染是需要的，但是包含在cVLPs中的E7表位不是由MHCⅠ类的抗原呈递［86］。事实上，这两种方法在小鼠模型中都提供了对体内肿瘤的防止作用。为了在细菌或植物表达系统中廉价地进行生产，cVLPs也被作了改良［87-92］。
这部分中所讨论的关于治疗性cVLPs的数据主要是临床前的，而关于人类罹患宫颈癌使用cVLP的安全性和治疗效果的信息有限。第一个cVLP的Ⅰ期临床试验发表于2007年。患有HPV16阳性高风险宫颈上皮内瘤样病变（CIN2/3）病人，给予HPV16L1E7cVLPs在接种患者体内具有良好的耐受性，并能诱导细胞免疫反应。不幸的是，按照临床疗效来说，使用损害病灶减少50%和HPV16DNA消失两条来衡量，在安慰剂组与接种疫苗组之间的两个参数中，没有一个具有显著性差异。此外，即使在细胞免疫被检测到的患者中，他们也没有明确的相关临床反应。这是与小鼠中的临床前数据完全不同的，临床前的小鼠数据表明，HPV诱发肿瘤的消除是与由cVLPs诱生的特异性E6可E7-CTL反应明确相关的。
HPV16L1cVLPs临床疗效差的一个可能的原因，是患者身体中预先存在着抗HPV16L1的中和抗体（由自然感染引发），这将限制cVLPs疫苗接种的有效性，如由Dasilva等用cVLPs接种小鼠所表明的［94］。为了规避这个问题，Dasilva等成功地证明，使用由牛乳头状瘤病毒（BPV）和犬口腔乳头状瘤病毒制作的异种cVLPs而仍与HPV16E7表位融合的疫苗，采用初次/加强接种的策略，可潜在地避开预先存在的中和抗体的影响［95］。由于观察到这种疫苗的安全属性是高的和强力的T细胞反应，继续进行观察这个初次/加强接种异种疫苗的方法，是否可以提高未来人类使用HPV cVLP疫苗试验中的相关反应，这将是有吸引力的。对接种cVLP疫苗抗人高风险宫颈疾病和小鼠模型的反应之间差异的另一个可能原因是疾病的局部性。小鼠TC-1（肿瘤细胞系组织培养1号）人工感染模型是全身性的，而CIN2/3是局限于患者的宫颈上皮。因此，接种疫苗的策略，把诱生的E7-特异性CTL反应针对或“吸引”到宫颈上皮中感染的部位可能是必须的。
就宫颈癌来说，抗宫颈病变的特异性CTLs被“堵住”在淋巴区域，而不能与肿瘤病灶相互作用。这种阻碍因素还没有完全确定，虽然这已被归因于T-调节细胞和髓源性抑制细胞的一种组合，影响肿瘤特异性CTLs的正确寻找靶标和杀伤功能［96-98］。显然，肿瘤所在处的微环境在妨碍免疫治疗的成功方面起着巨大的作用。总之，认为把治疗性cVLPS与免疫调节剂或其他治疗方法结合起来，这种做法将是适宜的，可改变肿瘤的微环境，从而提高疫苗的效能（如通过使CTL进入病变处，以及克服局部的免疫抑制环境）。这种组合研究，已对使用HPV治疗性DNA疫苗作了测试，依靠调节性T细胞的消耗，帮助提高了治疗的效能［99］。在另一个有吸引力的研究中，HPV治疗性DNA疫苗结合化疗药剂，结果提高了抗肿瘤的效果［100］。然而，这些方法仅在小鼠模型中进行了测试，因此，仍有待于观察这些方法是否可在临床环境中使用。
HPV VLPs作为呈递平台
HPV L1/L2-伪病毒颗粒作为DNA疫苗的载体
以裸DNA为基础的疫苗，具有诱发治疗性T细胞反应的巨大潜力。然而，在DNA疫苗这个领域中的一个主要障碍，是DNA疫苗进入靶细胞的递送，特别是抗原呈递细胞。利用L1/L2-VLPS使DNA疫苗壳体化，创建了感染而不会复制，HPV PsV是克服体内质粒递送困难的一种有前途的技术［53］。几个团队曾试验过使用L1-VLPs以便于递送DNA疫苗；然而，由于L1-VLPs缺乏HPV感染所必须的L2，与使用HPV PsVs相比，这种方法可能是处于劣势的。HPV PsVs作为抗非HPV疾病的一种疫苗递送平台，例如在呼吸道合胞病毒和HIV（人类免疫缺陷病毒）疫苗研究中使用的猴免疫缺陷病毒模型中，已经进行过测试［101，102］。在这两项研究中，针对各自的DNA抗原的特异CD8+T细胞反应，远高于裸DNA疫苗，因为HPV PsVs不感染完好的正常上皮，所以给小鼠采用阴道内接种。阴道内接种的批准，特别地考虑到黏膜免疫，许多病毒如HIV和HSV（单纯疱疹病毒）共享相同的感染位点；于是在黏膜局部（如阴道）的免疫反应诱导，对几个疾病系统都是有利的。Pen等制成了一种衣壳化的HPV16PsVs的编码卵清蛋白抗原的DNA疫苗［103］。这个结果表明，PsV的递送方法与其他的给药途径如基因枪递送相比，能够产生更强劲的卵清蛋白特异性CD8+反应，这对HPV PsV作为以DNA为基础的治疗性疫苗一个有前途的平台，提供了进一步的支持。
专家评论和关于今后五年研究的意见
虽然两种疫苗开发已获得成功，但仍然有许多问题需要解决。重要的是要认识到癌前病变是疫苗试验的主要疗效终点（高风险CIN或原位腺癌）。因此，疫苗对人群中宫颈癌发病率的真实影响的证明将需要时间，要受到10-30年HPV致癌的过程以及全国范围内疫苗交付延迟情况的影响。然而，我们觉得有可以乐观的理由，因为在澳大利亚开始实施的国家疫苗计划中，已经证明了疫苗在预防生殖道疣和宫颈癌前体两种病变的效果。此外，还没有关于疫苗的效果超过十年持续期和这方面的近期开发信息，所以，我们将不得不等待那些Ⅳ期研究的完成。如果免疫力减弱，则可能需要进行一次补强免疫。对达到终生免疫，是不是只要两剂就已足够而不是三剂（为了提高成本效益），或需要再加一剂补强接种（第四次免疫），仍然是尚待解决的问题。
我们也等待着默克公司目前正在进行的九价HPVL1-VLP疫苗效能研究的结果。这种疫苗针对两种引发生殖器疣的HPV基因型（6，11），而最重要的包含是在宫颈癌中发现的最常见的致癌基因型（HPV16、18、31、33、45、52、58）（译者注：原文的35，现据默克公司最新发布的资料校正为45）。如果证明这种疫苗在根除HPV相关肛门与生殖器恶性肿瘤中，所提供需要针对的广泛的致癌基因型持久覆盖，是有效和安全的，这将可能会显著地减少或不再需要在接种疫苗的适当人群中进行细胞学筛查。
从公共卫生的角度来看，引入九价HPV疫苗的成本问题不大可能解决。所以，与此平行的是，为了全球癌症的预防，和更好地使缺医少药的人群获得这种重要的机遇，要极大地努力开发通用的HPV L1-VLP疫苗以及以L2为基础的方法，用于当地生产低成本的普遍能够接受的疫苗。此外，必须继续努力简化HPV疫苗的购销交割，包括HPV VLP疫苗的公司交割与物色疫苗的其他代理机构，以及是否可以启动儿童的HPV疫苗接种。接种HPV疫苗对筛查的影响要仔细考虑，也必须注意成本效益，以及随着宫颈肿瘤流行的减少，从而使宫颈抹片筛查作为第一线筛查工具显得不足以起到预测作用。另一个需要解决的关键问题，是HPV VLP疫苗是否可以防止男女的HPV口腔感染，从而开发防止HPV相关头颈癌症的疫苗。目前，已有早期证据支持这种可能性［22］，而HPV相关头颈癌的发病率，应紧接着在男女中进行的Ⅳ期疫苗研究开展调查。
为了抗HPV或其他病原体和疾病的VLP疫苗学领域中的进一步改善，B细胞表位显示的剖析和T细胞表位呈递机制的继续研究是重要的。很显然，VLPs不都是以同一种方式表现的；例如，HPV VLP直接地激活DCs，但人类多瘤病毒样颗粒却不能。对这种免疫反应的机制和后果没有充分的了解，而可能影响对被嵌合的VLP携带的异种T细胞表位诱导的细胞免疫反应。把异种表位插入VLPS往往会降低颗粒的组装，所以这种折叠和组装过程的结构研究值得进行。这种免疫优势表位具有典型的构像——简言之，是由多个不同环上的残基形成的，而不是类似于被插入的线性异种表位（如L2 17-36）。这也许可以解释为什么插入的异种表位是具有免疫原性的，但通常远不及原来优势抗原表位位点的免疫原性水平。了解对递呈这些表位给B细胞，怎样的结构是最好的，还需要进行更多的研究，这样，它们相对于VLP中免疫优势HPV L1表位就可有更多的免疫原性。也许一个更好的方法是使用一种具备适当属性的单克隆抗体从一个随机的噬菌体文库中选择VLP结构，例如，特别是如果这种单克隆抗体能够识别一个构像表位。我们认为，在短期内对传染性病原体的异种表位以及甚至潜在的自身抗原表位如那些肿瘤抗原二者的VLP设计中，这将会是一个富有成效的领域。事实上，在遗传上对特有的恶性肿瘤具有高风险的患者中，能够产生保护性体液免疫和细胞免疫反应，对针对肿瘤抗原的预防性接种疫苗有越来越大的吸引力。
结论
由于HPV引发了目前世界上的生殖器疣和占所有癌症5%的病例，大量国家已许可了许多国家级预防性L1-VLP疫苗开展接种活动，这对人类的健康可能具有深远的好处。这种好处的早期迹象已可在澳大利亚见到，我们对后续的一种更具广泛保护性的第二代疫苗是乐观的，宫颈癌预防中的子宫颈抹片筛查的成功，和新出现实施的HPV DNA筛检，证明这种第二代疫苗是一个重要的完善。尽管如此，为了确保全球采用HPV疫苗接种和扩大对所有致癌基因型HPV的覆盖面，仍然还有许多工作要做。这些HPV VLP疫苗如何会这样有效，应该进行详细的研究，而关于主要机制的信息，还可利用于针对HPV以外病原体VLP疫苗的合理开发。正在进行的在多种VLPs中努力显示具有广泛保护性的L2表位，以开发一种泛-HPV疫苗，但是把异种表位插入到构象特异的具免疫优势的VLP表位中，仍然有许多问题要研究。HPV VLP也可用于显示其他抗原表位，并产生强劲的体液免疫反应，甚至对自身抗原也如此，这表明在许多其他方面的应用例如关节炎性疾病、阿尔茨海默氏病和其他感染性病原体是有前途的。HPV VLPs在它们直接激活DCS和其他的抗原呈递细胞的能力，以及呈递异种抗原表位包括病毒的和肿瘤的抗原，通过MHCⅠ类产生治疗性免疫反应的能力方面是特别具有吸引力的。使用这种嵌合的HPV L1-E7VLP仅作了一个单一的试验，这些研究仍然属于它们的起步阶段。然而，这是很清楚的，这种疫苗除了触发对E6和E7抗原的特异性T细胞反应以外，针对疾病部位的细胞毒性T细胞反应和克服局部的耐受性因素，可能会影响基于嵌合VLP的治疗性疫苗的成功。
关键问题
? 通过HPV VLP疫苗接种，宫颈癌和其他HPV相关恶性肿瘤是可能预防的，但是随后继续地证明它们对癌症发病率和死亡率的影响是需要的。
? 细胞学筛查和干预的措施，可减少初次调查人群的宫颈癌发病率60%-90%，而关于接种这种疫苗的成本效益也是必须考虑的。
? 为了实现HPV相关癌症发病率的显著降低，仔细地考虑如何在全球范围内推行接种HPV疫苗是需要的，但是为了达到这个目标是要有一个加强引导的时间。
? 广泛的HPV疫苗接种，将可能影响细胞学筛查方法的进行（如宫颈抹片筛查、HPV DNA检测，什么时候开始筛查以及筛查间隔时间的确定）。从广泛接种疫苗的角度来看，所有这些方法的成本效益都需要仔细地考虑，以及正确地实施以达到最大地降低宫颈癌的发病率。
? 低成本疫苗和克服交付中存在的物流障碍是作为现代疫苗的关键问题，这对发展中国家来说是不实际的。低成本表达系统中L1 VLP的热稳定配方的通用性和局地生产，作为有效的单剂使用将是有益的。
? 为了向其他代理商通报基于VLP疫苗的合理设计，人体对HPV VLP的免疫反应机制的进一步研究，特别是早期的先天性情况和长期记忆的诱导，它们是如何具有这样的免疫原性和有效的保护力，是需要了解的。
? 确定一种免疫相关蛋白是至关重要的，以便使患者们自己可以知道他们接种的疫苗是有效的（即那次对HPV的免疫）。
? 强劲而持久的保护，必须通过开发高度多价的L1-VLP配方，或尽可能地使用L2，以扩大到所有致癌基因型HPV。
? VLPs对异源线性表位如L2的显示以诱导高亲和力和持久的抗体表明是有前途的，但这种潜力还没有充分地实现，提示对免疫系统的呈递抗原不理想。为了了解对插入这些结构中的异源线性表位是如何最佳地产生类似的反应，更多的研究VLP中免疫优势构像表位是需要的。
? HPV感染和相关疾病是广泛存在的，所以，对治疗性疫苗仍然需要。
?嵌合VLP可有效地递送病毒抗原给MHCⅠ类，并产生强劲的细胞免疫反应。然而，迄今为止，嵌合VLP在患者体内没有产生治疗性反应，建议考虑针对病变部位的细胞免疫（如接种疫苗的途径和部位）和方法，来调节病变部位的微环境是必要的。
缩写词
VLP/VLPs，病毒样颗粒；HPV，人乳头状瘤病毒；HBV，人乙型肝炎病毒；DCs，树突状细胞；MHC，主要组织相容性复合体；CIN，宫颈上皮内瘤样病变；PV，乳头状瘤病毒；PsV，假乳头状瘤病毒颗粒；CRPV，棉尾兔乳头状瘤病毒；BPV，牛乳头状瘤病毒；L1△，L1衣壳蛋白亚单位；ROPV，兔口腔乳头状瘤病毒；PVX，马铃薯X病毒；AAVLPs，腺伴随病毒样颗粒；CTL，细胞毒性T-淋巴细胞；cVLPs，嵌合病毒样颗粒；HIV，人类免疫缺陷病毒；HSV，单纯疱疹病毒
参考文献103篇略