新方法给出了活细胞中蛋白-RNA相互作用的全景图
2009-05-26 20:36:48   来源：   作者：  评论：0 点击：

有证据表明，并不是所有的DNA 如人们所破译的那样。最近几年，我们已经知道20世纪发现的生命分子（译者注：指DNA）本身不会也不能解释一个人与一条虫之间复杂性的巨大差别。 科学家被迫将目光转向了RNA——一种DNA的直接、也更复杂的转录本。但是在活细胞中研究RNA的调节一直被方法学难题所困扰，不光限制了结果的准确性也限制了我们对RNA在人类疾病中作用的了解。
不过，现在这一窘境被Robert B. Darnell和他的研究小组改变了，相关研究成果发表在11月2日的《自然》在线专题进展上。Robert B. Darnell是洛克菲勒大学分子神经肿瘤学的负责人和霍华德•休斯医学研究所的研究员。
通过改良试管中的主流技术，结合高通量技术，研究小组开发出一个基因组范围的平台来研究在完整无损的活细胞中特定的蛋白是如何调控RNA的。该平台可以让研究人员在一次实验中鉴定出每条RNA链的每一段序列所结合的蛋白。实验结果能准确无误的并且是史无前例的看出一条虫和一个人（均含有拥有25,000个基因）的RNA有多少差异并解释两者是如何不同的。
“相对于有限套数的基因，RNA提供了一种使细胞变得更加复杂的途径，” Darnell（洛克菲勒大学的Robert 和 Harriet Heilbrunn教授）说，“但是，不同的条件、疾病、细胞类型中，RNA是如何被调控的呢？有了这一平台，现在我们就有办法来解答所有这些问题。”
从活体组织中抽提蛋白-RNA复合物，传统方法是使用分子，但经常提取的只是RNA，或者是不需要的残留复合物，因为结合的蛋白太不稳固以致在纯化过程中就从（蛋白-RNA）复合物中脱落下来。为了解决这个问题，Darnell和他的团队从试管生化反应得到灵感——当这些调节蛋白结合到RNA上的那一刻立即使用分子粘合剂！这一方法应用到高通量测序就叫高通量测序-交联免疫沉淀，简称HITS-CLIP。
既然RNA和RNA结合蛋白融合在一起，研究人员就可以在剧烈的蛋白纯化过程中而真的不用担心搅拌抽提物丢失RNA，最后，只剩下结合蛋白的RNA片段，然后这些片段被送到洛克菲勒进行高通量测序，在RSSSD的帮助下，这些序列与基因组比对，找出匹配的片段，最终拼出每个转录出的RNA的蛋白结合序列的全景图。
当DNA转录出RNA，这些初级转录本被分成许多称为外显子的区域，之间被空白（即非编码序列——内含子）间隔。为转换成某种（编码）信息，所有的空白必须去除，但若某个外显子被错误的漏掉了，将产生一个完全不同的信息，翻译出不同的蛋白。“这就是RNA剪切，” Donny Licatalosi（第一作者，实验室的准博士后）说，“它使基因数目相对较少的组织大大增加了多样性和复杂性。”
在过去，研究小组利用一些错综复杂的程序来分析实验证据和推论以预测转录本上的调控点。“现在，我们直接在生化层面就可以确认这些发生在大脑中的调控剪切的相互作用，” Licatalosi说。
就如证实的那样，“这次观察到的图谱——很有趣——就像我们预测的那样，” Darnell说。
Darnell, Licatalosi和他们的同事Aldo Mele（研究助理），John Fak（研究助理），Sung-Wook Chi（医学生物信息学研究生），Xuning Wang（生物信息学助理主任），Jennifer Darnell（研究助理教授），看着一个叫Nova2的RNA结合蛋白——只在神经元中被发现。他们发现：根据Nova2结合到RNA上的位置，他们可以预测并直接观察到哪个外显子在最终的转录本中是被保留还是被剪除，以及产生什么样的蛋白。“当条件不同、类型不同时，细胞在如何调控这些RNA上似乎存在很大的困难，” Darnell说。“当RNA发展到能产生一种更加稳定的自身拷贝——DNA，它不会把自己写掉而只作为教科书中的遗迹，相反，它处于细胞复杂过程中的中心位置。”